Děkujeme za návštěvu webu nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro co nejlepší uživatelský komfort doporučujeme používat nejnovější verzi prohlížeče (nebo v prohlížeči Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Abychom zajistili trvalou podporu, tento web nebude obsahovat žádné styly ani JavaScript.
Kosterní sval je heterogenní tkáň složená převážně z myofibril, které se u lidí obvykle dělí na tři typy: jeden „pomalý“ (typ 1) a dva „rychlé“ (typy 2A a 2X). Heterogenita mezi tradičními typy myofibril a v rámci nich však zůstává nedostatečně pochopena. Použili jsme transkriptomické a proteomické přístupy na 1050, respektive 1038 jednotlivých myofibril z lidského vastus lateralis. Proteomická studie zahrnovala muže a transkriptomická studie 10 mužů a 2 ženy. Kromě izoforem těžkého řetězce myozinu jsme identifikovali metabolické proteiny, ribozomální proteiny a buněčné junkční proteiny jako zdroje vícerozměrné variability intermyofibril. Navzdory identifikaci shluků pomalých a rychlých vláken naše data naznačují, že vlákna typu 2X jsou fenotypově nerozeznatelná od ostatních rychlých vláken. Klasifikace založená na těžkém řetězci myozinu navíc není dostatečná k popisu fenotypu myofibril u nemalinních myopatií. Celkově naše data naznačují vícerozměrnou heterogenitu myofilament, přičemž zdroje variací sahají i za izoformy těžkého řetězce myozinu.
Buněčná heterogenita je inherentním rysem všech biologických systémů, který umožňuje buňkám specializovat se na uspokojení různých potřeb tkání a buněk.1 Tradiční pohled na heterogenitu vláken kosterního svalstva spočívá v tom, že motorické neurony definují typ vlákna v rámci motorické jednotky a že typ vlákna (tj. typ 1, typ 2A a typ 2X u lidí) je určen charakteristikami izoforem myosinového těžkého řetězce (MYH).2 Toto bylo zpočátku založeno na jejich nestabilitě pH ATPázy,3,4 a později na jejich molekulární expresi MYH.5 S identifikací a následným přijetím „smíšených“ vláken, která koexprimují více MYH v různých poměrech, jsou však vlákna kosterního svalstva stále více vnímána jako kontinuum spíše než jako odlišné typy vláken.6 Navzdory tomu se obor stále silně spoléhá na MYH jako primární klasifikátor pro klasifikaci myoflaken, což je názor pravděpodobně ovlivněn omezeními a významnými zkresleními raných studií na hlodavcích, jejichž expresní profily MYH a rozsah typů vláken se liší od lidských.2 Situaci dále komplikuje skutečnost, že různé lidské kosterní svaly vykazují rozmanitou škálu typů vláken.7 Vastus lateralis je smíšený sval se středním (a tedy reprezentativním) profilem exprese MYH.7 Navíc je díky snadnému odběru vzorků nejlépe prozkoumaným svalem u lidí.
Nestranné zkoumání diverzity vláken kosterního svalstva pomocí výkonných „omických“ nástrojů je tedy kritické, ale také náročné, částečně kvůli vícejaderné povaze vláken kosterního svalstva. Technologie transkriptomiky8,9 a proteomiky10 však v posledních letech prošly revolucí v citlivosti díky různým technologickým pokrokům, které umožňují analýzu kosterního svalstva s rozlišením jednotlivých vláken. V důsledku toho bylo dosaženo významného pokroku v charakterizaci diverzity jednotlivých vláken a jejich reakce na atrofické podněty a stárnutí11,12,13,14,15,16,17,18. Důležité je, že tyto technologické pokroky mají klinické využití, což umožňuje detailnější a přesnější charakterizaci dysregulace spojené s onemocněním. Například patofyziologie nemalinové myopatie, jednoho z nejčastějších dědičných svalových onemocnění (MIM 605355 a MIM 161800), je složitá a matoucí.19,20 Lepší charakterizace dysregulace vláken kosterního svalstva by proto mohla vést k významnému pokroku v našem chápání tohoto onemocnění.
Vyvinuli jsme metody pro transkriptomickou a proteomickou analýzu jednotlivých vláken kosterního svalstva ručně izolovaných ze vzorků lidských biopsií a aplikovali je na tisíce vláken, což nám umožnilo zkoumat buněčnou heterogenitu vláken lidského kosterního svalstva. V průběhu této práce jsme demonstrovali sílu transkriptomického a proteomického fenotypování svalových vláken a identifikovali metabolické, ribozomální a buněčné junkční proteiny jako významné zdroje variability mezi vlákny. Dále jsme pomocí tohoto proteomického pracovního postupu charakterizovali klinický význam myopatie hlístic v jednotlivých vláknech kosterního svalstva a odhalili koordinovaný posun směrem k neoxidačním vláknům nezávislým na typu vlákna na základě myopatie myopatie myopatií myopatií myopatií myopatií myopatií myopatií myopatií myopatií myopatií myopatií.
Pro zkoumání heterogenity lidských kosterních svalových vláken jsme vyvinuli dva pracovní postupy, které umožňují analýzu transkriptomu a proteomu jednotlivých vláken kosterního svalstva (obrázek 1A a doplňkový obrázek 1A). Vyvinuli a optimalizovali jsme několik metodologických kroků, od ukládání vzorků a zachování integrity RNA a proteinů až po optimalizaci propustnosti pro každý přístup. Pro analýzu transkriptomu bylo toho dosaženo vložením molekulárních čárových kódů specifických pro vzorek v počátečním kroku reverzní transkripce, což umožnilo sloučení 96 vláken pro efektivní následné zpracování. Hlubší sekvenování (±1 milion čtení na vlákno) ve srovnání s tradičními přístupy s jednou buňkou dále obohatilo transkriptomová data.21 Pro proteomiku jsme použili krátký chromatografický gradient (21 minut) v kombinaci se sběrem dat DIA-PASEF na hmotnostním spektrometru timsTOF pro optimalizaci hloubky proteomu při zachování vysoké propustnosti. 22,23 Pro zkoumání heterogenity zdravých vláken kosterního svalstva jsme charakterizovali transkriptomy 1 050 jednotlivých vláken od 14 zdravých dospělých dárců a proteomy 1 038 vláken od 5 zdravých dospělých dárců (doplňková tabulka 1). V tomto článku jsou tyto datové sady označovány jako transkriptomy a proteomy s 1 000 vlákny. Náš přístup detekoval celkem 27 237 transkriptů a 2 983 proteinů v transkriptomické a proteomické analýze s 1 000 vlákny (obrázek 1A, doplňkové datové sady 1–2). Po filtrování transkriptomických a proteomických datových sad pro >1 000 detekovaných genů a 50 % platných hodnot na vlákno byly provedeny následné bioinformatické analýzy pro 925 a 974 vláken v transkriptomu a proteomu. Po filtrování bylo na jedno vlákno detekováno průměrně 4257 ± 1557 genů a 2015 ± 234 proteinů (průměr ± SD) s omezenou interindividuální variabilitou (doplňkové obrázky 1B–C, doplňkové datové sady 3–4). Variabilita v rámci subjektu však byla u jednotlivých účastníků výraznější, pravděpodobně kvůli rozdílům ve výtěžku RNA/proteinů mezi vlákny různých délek a ploch průřezu. U většiny proteinů (>2000) byl variační koeficient pod 20 % (doplňkový obrázek 1D). Obě metody umožnily zachytit široký dynamický rozsah transkriptů a proteinů s vysoce exprimovanými signaturami důležitými pro svalovou kontrakci (např. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (doplňkové obrázky 1E–F). Většina identifikovaných znaků byla společná mezi transkriptomickými a proteomickými datovými sadami (doplňkový obrázek 1G) a průměrné intenzity UMI/LFQ těchto znaků byly poměrně dobře korelovány (r = 0,52) (doplňkový obrázek 1H).
Pracovní postup pro transkriptomiku a proteomiku (vytvořený pomocí BioRender.com). BD Křivky dynamického rozsahu pro MYH7, MYH2 a MYH1 a vypočítané prahové hodnoty pro přiřazení typu vláken. E, F Distribuce exprese MYH napříč vlákny v transkriptomických a proteomických datových sadách. G, H Grafy UMAP (Uniform Diversity Approximation and Projection) pro transkriptomiku a proteomiku, barevné podle typu vláken založených na MYH. I, J Grafy znázorňující expresi MYH7, MYH2 a MYH1 v transkriptomických a proteomických datových sadách.
Původně jsme se rozhodli přiřadit každému vláknu typ vlákna založený na MYH pomocí optimalizovaného přístupu, který využívá vysokou citlivost a dynamický rozsah exprese MYH v omických datových sadách. Předchozí studie používaly libovolné prahové hodnoty k označení vláken jako čistých typů 1, 2A, 2X nebo smíšených na základě fixního procenta exprese různých MYH11,14,24. Použili jsme jiný přístup, ve kterém byla exprese každého vlákna seřazena podle MYH, které jsme použili k typizaci vláken: MYH7, MYH2 a MYH1, což odpovídá vláknům typu 1, typu 2A a typu 2X. Poté jsme matematicky vypočítali spodní inflexní bod každé výsledné křivky a použili jej jako prahovou hodnotu pro přiřazení vláken jako pozitivních (nad prahovou hodnotou) nebo negativních (pod prahovou hodnotou) pro každý MYH (obrázek 1B–D). Tato data ukazují, že MYH7 (obrázek 1B) a MYH2 (obrázek 1C) mají výraznější on/off expresní profily na úrovni RNA ve srovnání s úrovní proteinů. Na úrovni proteinů skutečně jen velmi málo vláken neexprimovalo MYH7 a žádné vlákno nemělo 100% expresi MYH2. Dále jsme použili předem stanovené prahové hodnoty exprese k přiřazení typů vláken založených na MYH ke všem vláknům v každém souboru dat. Například vlákna MYH7+/MYH2-/MYH1- byla přiřazena k typu 1, zatímco vlákna MYH7-/MYH2+/MYH1+ byla přiřazena ke smíšenému typu 2A/2X (úplný popis viz doplňková tabulka 2). Spojení všech vláken nám ukázalo pozoruhodně podobné rozložení typů vláken založených na MYH na úrovni RNA (obrázek 1E) i proteinů (obrázek 1F), zatímco relativní složení typů vláken založených na MYH se u jednotlivých jedinců lišilo, jak se očekávalo (doplňkový obrázek 2A). Většina vláken byla klasifikována buď jako čistý typ 1 (34–35 %), nebo typ 2A (36–38 %), ačkoli byl detekován i významný počet smíšených vláken typu 2A/2X (16–19 %). Výrazným rozdílem je, že čistá vlákna typu 2X mohla být detekována pouze na úrovni RNA, ale nikoli na úrovni proteinu, což naznačuje, že rychlá exprese MYH je alespoň částečně regulována posttranskripčně.
Naši metodu typizace vláken MYH založenou na proteomice jsme validovali pomocí dot blottingu na bázi protilátek a obě metody dosáhly 100% shody v identifikaci čistých vláken typu 1 a typu 2A (viz doplňkový obrázek 2B). Proteomický přístup byl však citlivější, účinnější při identifikaci smíšených vláken a kvantifikaci podílu každého genu MYH v každém vlákně. Tato data demonstrují účinnost použití objektivního, vysoce citlivého omického přístupu k charakterizaci typů vláken kosterního svalstva.
Kombinované informace poskytnuté transkriptomikou a proteomikou jsme poté použili k objektivní klasifikaci myofibril na základě jejich kompletního transkriptomu nebo proteomu. Pomocí metody uniform manifold approximation and projection (UMAP) k redukci dimenzionality na šest hlavních složek (doplňkové obrázky 3A–B) jsme byli schopni vizualizovat variabilitu myofibril v transkriptomu (obrázek 1G) a proteomu (obrázek 1H). Je pozoruhodné, že myofibrilky nebyly seskupeny podle účastníků (doplňkové obrázky 3C–D) ani podle testovacích dnů (doplňkový obrázek 3E) ani v transkriptomických, ani v proteomických souborech dat, což naznačuje, že variabilita v rámci subjektu ve vláknech kosterního svalstva je vyšší než variabilita mezi subjekty. V grafu UMAP se objevily dva odlišné shluky představující „rychlá“ a „pomalá“ myofibrilky (obrázky 1G–H). Myofibry MYH7+ (pomalé) byly shlukovány na kladném pólu UMAP1, zatímco myofibry MYH2+ a MYH1+ (rychlé) byly shlukovány na záporném pólu UMAP1 (obrázky 1I–J). Na základě exprese MYH však nebyl proveden žádný rozdíl mezi typy rychlých myofibril (tj. typ 2A, typ 2X nebo smíšené 2A/2X), což naznačuje, že exprese MYH1 (obrázek 1I–J) nebo jiných klasických markerů 2X myofibril, jako je ACTN3 nebo MYLK2 (doplňkové obrázky 4A–B), nerozlišuje mezi různými typy myofibril, pokud jde o celý transkriptom nebo proteom. Navíc ve srovnání s MYH2 a MYH7 bylo s MYH1 pozitivně korelováno jen málo transkriptů nebo proteinů (doplňkové obrázky 4C–H), což naznačuje, že hojnost MYH1 plně neodráží transkriptom/proteom myofibril. Podobné závěry byly dosaženy při hodnocení smíšené exprese tří izoforem MYH na úrovni UMAP (doplňkové obrázky 4I–J). Zatímco vlákna 2X lze identifikovat na úrovni transkriptu pouze na základě kvantifikace MYH, vlákna MYH1+ nelze rozlišit od ostatních rychlých vláken, pokud se vezme v úvahu celý transkriptom nebo proteom.
Jako úvodní průzkum heterogenity pomalých vláken nad rámec MYH jsme posoudili čtyři zavedené proteiny specifické pro daný typ pomalých vláken: TPM3, TNNT1, MYL3 a ATP2A22. Podtypy pomalých vláken vykazovaly vysoké, i když ne dokonalé, Pearsonovy korelace s MYH7 jak v transkriptomice (doplňkový obrázek 5A), tak v proteomice (doplňkový obrázek 5B). Přibližně 25 % a 33 % pomalých vláken nebylo klasifikováno jako čistě pomalá vlákna všemi podtypy genů/proteinů v transkriptomice (doplňkový obrázek 5C) a proteomice (doplňkový obrázek 5D). Klasifikace pomalých vláken založená na více podtypech genů/proteinů proto představuje další složitost, a to i u proteinů, o nichž je známo, že jsou specifické pro daný typ vláken. To naznačuje, že klasifikace vláken založená na izoformách jedné genové/proteinové rodiny nemusí adekvátně odrážet skutečnou heterogenitu vláken kosterního svalstva.
Pro další zkoumání fenotypové variability vláken lidského kosterního svalstva v měřítku celého omického modelu jsme provedli nezkreslenou redukci dimenzionality dat pomocí analýzy hlavních komponent (PCA) (obrázek 2A). Podobně jako u grafů UMAP ani účastník, ani den testování neovlivnili shlukování vláken na úrovni PCA (doplňkové obrázky 6A–C). V obou datových sadách byl typ vláken založený na MYH vysvětlen pomocí PC2, která ukázala shluk pomalu se stahujících vláken typu 1 a druhý shluk obsahující rychle se stahující vlákna typu 2A, typu 2X a smíšená vlákna 2A/2X (obrázek 2A). V obou datových sadách byly tyto dva shluky propojeny malým počtem smíšených vláken typu 1/2A. Jak se očekávalo, analýza nadměrného zastoupení hlavních faktorů ovlivňujících PC potvrdila, že PC2 byla řízena kontraktilními a metabolickými signaturami (obrázek 2B a doplňkové obrázky 6D–E, doplňkové datové sady 5–6). Celkově se ukázalo, že typ vláken založený na MYH je dostatečný k vysvětlení kontinuální variability podél PC2, s výjimkou tzv. 2X vláken, která byla distribuována po celém transkriptomu v rámci rychlého klastru.
A. Grafy hlavních komponent (PCA) datových sad transkriptomu a proteomu, vybarvené podle typu vlákna na základě MYH. B. Analýza obohacení transkriptových a proteinových driverů v PC2 a PC1. Statistická analýza byla provedena pomocí balíčku clusterProfiler a p-hodnot upravených dle Benjaminiho-Hochberga. C, D. PCA grafy, vybarvené podle termínů ontologie genů mezibuněčné adheze (GO) v transkriptomu a termínů GO kostamer v proteomu. Šipky představují transkriptové a proteinové drivery a jejich směry. E, F. Grafy klinicky relevantních znaků znázorňující expresní gradienty nezávislé na typu pomalých/rychlých vláken. G, H. Korelace mezi drivery PC2 a PC1 v transkriptomech a proteomech.
Neočekávaně se zjistilo, že typ myofiber založený na MYH vysvětlil pouze druhý nejvyšší stupeň variability (PC2), což naznačuje, že jiné biologické faktory nesouvisející s typem myofiber založeným na MYH (PC1) hrají důležitou roli v regulaci heterogenity vláken kosterního svalstva. Analýza nadměrného zastoupení nejvýznamnějších faktorů v PC1 odhalila, že variabilita v PC1 byla primárně určena buněčnou adhezí a obsahem ribozomů v transkriptomu a kostamerami a ribozomálními proteiny v proteomu (obrázek 2B a doplňkové obrázky 6D–E, doplňková datová sada 7). V kosterním svalu kostamery spojují Z-disk se sarkolemou a podílejí se na přenosu síly a signalizaci. 25 Anotované PCA grafy s využitím znaků buněčné adheze (transkriptom, obrázek 2C) a kostamer (proteom, obrázek 2D) odhalily silný posun doleva v PC1, což naznačuje, že tyto znaky jsou obohaceny o určitá vlákna.
Podrobnější zkoumání shlukování myofiber na úrovni UMAP odhalilo, že většina znaků vykazovala spíše expresní gradient založený na MYH než specifický pro jednotlivé subklastry myofiber. Tato kontinuita byla pozorována u několika genů spojených s patologickými stavy (obrázek 2E), jako je CHCHD10 (neuromuskulární onemocnění), SLIT3 (svalová atrofie) a CTDNEP1 (svalové onemocnění). Tato kontinuita byla pozorována také napříč proteomem, včetně proteinů spojených s neurologickými poruchami (UGDH), inzulínovou signalizací (PHIP) a transkripcí (HIST1H2AB) (obrázek 2F). Tato data dohromady naznačují kontinuitu v heterogenitě pomalých/rychlých záškubů nezávislé na typu vláken napříč různými myofibrily.
Je zajímavé, že řídicí geny v PC2 vykazovaly dobrou korelaci transkriptomu a proteomu (r = 0,663) (obrázek 2G), což naznačuje, že typy pomalých a rychlých svalových vláken, a zejména kontraktilní a metabolické vlastnosti vláken kosterního svalstva, jsou transkripčně regulovány. Řidičské geny v PC1 však nevykazovaly žádnou korelaci transkriptomu a proteomu (r = -0,027) (obrázek 2H), což naznačuje, že variace nesouvisející s typy pomalých/rychlých vláken jsou z velké části regulovány posttranskripčně. Vzhledem k tomu, že variace v PC1 byly primárně vysvětleny termíny ontologie ribozomálních genů a vzhledem k tomu, že ribozomy hrají v buňce klíčovou a specializovanou roli tím, že se aktivně podílejí na translaci proteinů a ovlivňují ji,31 jsme se dále vydali na výzkum této neočekávané heterogenity ribozomů.
Nejprve jsme obarvili graf proteomické analýzy hlavních komponent podle relativního zastoupení proteinů v GOCC termínu „cytoplazmatický ribozom“ (obrázek 3A). Ačkoli je tento termín obohacen na pozitivní straně PC1, což vede k malému gradientu, ribozomální proteiny řídí dělení v obou směrech PC1 (obrázek 3A). Mezi ribozomální proteiny obohacené na negativní straně PC1 patřily RPL18, RPS18 a RPS13 (obrázek 3B), zatímco RPL31, RPL35 a RPL38 (obrázek 3C) byly hlavními hnacími silami na pozitivní straně PC1. Je zajímavé, že RPL38 a RPS13 byly vysoce exprimovány v kosterním svalu ve srovnání s jinými tkáněmi (doplňkový obrázek 7A). Tyto charakteristické ribozomální signatury v PC1 nebyly pozorovány v transkriptomu (doplňkový obrázek 7B), což naznačuje posttranskripční regulaci.
A. Graf analýzy hlavních komponent (PCA) zbarvený podle termínů cytoplazmatické ribozomální genové ontologie (GO) napříč proteomem. Šipky označují směr proteinem zprostředkované variace v grafu PCA. Délka čáry odpovídá skóre hlavní komponenty pro daný protein. B, C. Grafy PCA charakteristik pro RPS13 a RPL38. D. Neřízená hierarchická shlukovací analýza cytoplazmatických ribozomálních proteinů. E. Strukturní model ribozomu 80S (PDB: 4V6X) zvýrazňující ribozomální proteiny s různým zastoupením ve vláknech kosterního svalstva. F. Ribozomální proteiny s různou stechiometrií lokalizované v blízkosti výstupního kanálu mRNA.
Koncepty ribozomální heterogenity a specializace byly navrženy již dříve, kdy přítomnost odlišných subpopulací ribozomů (ribozomální heterogenita) může přímo ovlivňovat translaci proteinů v různých tkáních32 a buňkách33 prostřednictvím selektivní translace specifických poolů mRNA transkriptů34 (ribozomální specializace). Pro identifikaci subpopulací ribozomálních proteinů koexprimovaných ve vláknech kosterního svalstva jsme provedli nekontrolovanou hierarchickou shlukovací analýzu ribozomálních proteinů v proteomu (obrázek 3D, doplňková datová sada 8). Jak se očekávalo, ribozomální proteiny se neshlukovaly podle typu vláken na základě MYH. Identifikovali jsme však tři odlišné shluky ribozomálních proteinů; první shluk (ribozomální_shluk_1) je koregulován s RPL38, a proto má zvýšenou expresi ve vláknech s pozitivním profilem PC1. Druhý shluk (ribozomální_shluk_2) je koregulován s RPS13 a je zvýšený ve vláknech s negativním profilem PC1. Třetí shluk (ribozomální_shluk_3) nevykazuje koordinovanou diferenciální expresi ve vláknech kosterního svalstva a lze jej považovat za „jádrový“ ribozomální protein kosterního svalstva. Oba ribozomální shluky 1 a 2 obsahují ribozomální proteiny, u kterých bylo dříve prokázáno, že regulují alternativní translaci (např. RPL10A, RPL38, RPS19 a RPS25) a funkčně ovlivňují vývoj (např. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 V souladu s výsledky PCA pozorovaná heterogenní reprezentace těchto ribozomálních proteinů napříč vlákny také vykazovala kontinuitu (doplňkový obrázek 7C).
Pro vizualizaci umístění heterogenních ribozomálních proteinů v ribozomu jsme použili strukturní model lidského 80S ribozomu (Protein Data Bank: 4V6X) (obrázek 3E). Po izolaci ribozomálních proteinů patřících do různých ribozomálních klastrů nebyly jejich umístění úzce srovnaná, což naznačuje, že náš přístup nedokázal zajistit obohacení určitých oblastí/frakcí ribozomu. Je však zajímavé, že podíl proteinů s velkými podjednotkami v klastru 2 byl nižší než v klastrech 1 a 3 (doplňkový obrázek 7D). Pozorovali jsme, že proteiny se změněnou stechiometrií ve vláknech kosterního svalstva byly převážně lokalizovány na povrchu ribozomu (obrázek 3E), což je v souladu s jejich schopností interagovat s prvky vnitřního místa vstupu ribozomu (IRES) v různých populacích mRNA, a tím koordinovat selektivní translaci. 40, 41 Kromě toho se mnoho proteinů se změněnou stechiometrií ve vláknech kosterního svalstva nacházelo v blízkosti funkčních oblastí, jako je výstupní tunel mRNA (obrázek 3F), které selektivně regulují translační prodloužení a zastavení specifických peptidů. 42 Souhrnně řečeno, naše data naznačují, že stechiometrie ribozomálních proteinů kosterního svalstva vykazuje heterogenitu, což vede k rozdílům mezi vlákny kosterního svalstva.
Dále jsme se zaměřili na identifikaci charakteristik rychlých a pomalých vláken a prozkoumání mechanismů jejich transkripční regulace. Porovnáním shluků rychlých a pomalých vláken definovaných pomocí UMAP ve dvou datových sadách (obrázky 1G–H a 4A–B) identifikovali transkriptomické a proteomické analýzy 1366, respektive 804 odlišně se vyskytujících znaků (obrázky 4A–B, doplňkové datové sady 9–12). Pozorovali jsme očekávané rozdíly v charakteristikách souvisejících se sarkomerami (např. tropomyosin a troponin), vazbou excitace a kontrakce (izoformy SERCA) a energetickým metabolismem (např. ALDOA a CKB). Transkripty a proteiny regulující ubikvitinaci proteinů byly navíc odlišně exprimovány v rychlých a pomalých vláken (např. USP54, SH3RF2, USP28 a USP48) (obrázky 4A–B). Navíc byl gen mikrobiálního proteinu RP11-451G4.2 (DWORF), u kterého bylo dříve prokázáno, že je diferencovaně exprimován napříč typy svalových vláken jehněčího masa43 a zvyšuje aktivitu SERCA v srdečním svalu44, významně zvýšen v pomalých kosterních svalových vláknech (obrázek 4A). Podobně na úrovni jednotlivých vláken byly pozorovány významné rozdíly ve známých signaturách, jako jsou izoformy laktátdehydrogenázy související s metabolismem (LDHA a LDHB, obrázek 4C a doplňkový obrázek 8A)45,46, stejně jako dříve neznámé signatury specifické pro daný typ vláken (jako IRX3, USP54, USP28 a DPYSL3) (obrázek 4C). Mezi transkriptomickými a proteomickými soubory dat došlo k významnému překrytí diferencovaně exprimovaných znaků (doplňkový obrázek 8B), stejně jako k násobné korelaci změn způsobené především výraznější diferenciální expresí znaků sarkomer (doplňkový obrázek 8C). Je pozoruhodné, že některé signatury (např. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) vykazovaly silnou posttranskripční regulaci pouze na proteomické úrovni a měly specifické expresní profily pro typ pomalých/rychlých záškubových vláken (doplňkový obrázek 8C).
A a B sopečné grafy porovnávající pomalé a rychlé klastry identifikované pomocí grafů uniform manifold approximation and projection (UMAP) na obrázcích 1G–H. Barevné tečky představují transkripty nebo proteiny, které se významně liší při FDR < 0,05, a tmavší tečky představují transkripty nebo proteiny, které se významně liší při logaritmické změně > 1. Obousměrná statistická analýza byla provedena pomocí Waldova testu DESeq2 s p-hodnotami upravenými Benjaminiho-Hochbergem (transkriptomika) nebo metodou lineárního modelu Limma s empirickou Bayesovskou analýzou následovanou Benjaminiho-Hochbergovou úpravou pro vícenásobná srovnání (proteomika). C Signaturní grafy vybraných diferencovaně exprimovaných genů nebo proteinů mezi pomalými a rychlými vlákny. D Analýza obohacení významně diferencovaně exprimovaných transkriptů a proteinů. Překrývající se hodnoty jsou obohaceny v obou datových sadách, hodnoty transkriptomu jsou obohaceny pouze v transkriptomu a hodnoty proteomu jsou obohaceny pouze v proteomu. Statistická analýza byla provedena pomocí balíčku clusterProfiler s p-hodnotami upravenými Benjaminiho-Hochbergem. E. Transkripční faktory specifické pro typ vláken identifikované SCENIC na základě skóre specificity regulátorů odvozených z SCENIC a rozdílné exprese mRNA mezi typy vláken. F. Profilování vybraných transkripčních faktorů diferencovaně exprimovaných mezi pomalými a rychlými vlákny.
Následně jsme provedli analýzu nadměrného zastoupení diferencovaně zastoupených genů a proteinů (obrázek 4D, doplňková datová sada 13). Obohacení dráhy o znaky, které se mezi oběma datovými sadami lišily, odhalilo očekávané rozdíly, jako jsou procesy β-oxidace mastných kyselin a metabolismu ketonů (pomalá vlákna), kontrakce myofilament/svalů (rychlá a pomalá vlákna) a katabolické procesy sacharidů (rychlá vlákna). Aktivita serinové/threoninové proteinfosfatázy byla také zvýšena u rychlých vláken, což bylo způsobeno znaky, jako jsou regulační a katalytické podjednotky fosfatázy (PPP3CB, PPP1R3D a PPP1R3A), o kterých je známo, že regulují metabolismus glykogenu (47) (doplňkové obrázky 8D–E). Mezi další dráhy obohacené o rychlá vlákna patřily processingová (P-) tělíska (YTHDF3, TRIM21, LSM2) v proteomu (doplňkový obrázek 8F), potenciálně zapojená do posttranskripční regulace (48), a aktivita transkripčních faktorů (SREBF1, RXRG, RORA) v transkriptomu (doplňkový obrázek 8G). Pomalá vlákna byla obohacena o oxidoreduktázovou aktivitu (BDH1, DCXR, TXN2) (doplňkový obrázek 8H), vazbu amidů (CPTP, PFDN2, CRYAB) (doplňkový obrázek 8I), aktivitu extracelulární matrix (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (doplňkový obrázek 8J) a aktivitu receptor-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (doplňkový obrázek 8K).
Abychom získali hlubší vhled do transkripční regulace, která je základem charakteristik typu pomalých/rychlých svalových vláken, provedli jsme analýzu obohacení transkripčních faktorů pomocí programu SCENIC49 (doplňková datová sada 14). Mnoho transkripčních faktorů bylo významně obohaceno mezi rychlými a pomalými svalovými vlákny (obrázek 4E). Patřily sem transkripční faktory, jako je MAFA, který byl dříve spojován s vývojem rychlých svalových vláken,50 a také několik transkripčních faktorů, které dříve nebyly spojovány s genovými programy specifickými pro daný typ svalových vláken. Mezi nimi byly PITX1, EGR1 a MYF6 nejvíce obohacenými transkripčními faktory v rychlých svalových vláken (obrázek 4E). Naproti tomu ZSCAN30 a EPAS1 (také známý jako HIF2A) byly nejvíce obohacenými transkripčními faktory v pomalých svalových vláken (obrázek 4E). V souladu s tím byl MAFA exprimován ve vyšších hladinách v oblasti UMAP odpovídající rychlým svalovým vláknům, zatímco EPAS1 měl opačný expresní vzorec (obrázek 4F).
Kromě známých genů kódujících proteiny existuje řada nekódujících biotypů RNA, které se mohou podílet na regulaci lidského vývoje a onemocnění.51, 52 V transkriptomických souborech dat vykazuje několik nekódujících RNA specificitu pro typ vláken (obrázek 5A a doplňková datová sada 15), včetně LINC01405, která je vysoce specifická pro pomalá vlákna a u pacientů s mitochondriální myopatií je uváděna jako snížená ve svalech.53 Naproti tomu RP11-255P5.3, odpovídající genu lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)54, vykazuje specificitu pro typ rychlých vláken. Jak LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), tak RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) vykazují specificitu pro kosterní svalstvo (doplňkové obrázky 9A–B) a nemají žádné známé kontraktilní geny v rámci svého 1 Mb genomového okolí, což naznačuje, že hrají specializovanou roli v regulaci typů vláken spíše než v regulaci sousedních kontraktilních genů. Profily exprese specifické pro pomalé/rychlé typy vláken u LINC01405 a RP11-255P5.3 byly potvrzeny pomocí RNAscope (obrázky 5B–C).
A. Nekódující RNA transkripty jsou významně regulovány v pomalých a rychlých svalových vláken. B. Reprezentativní snímky RNAscope ukazující specificitu pomalých a rychlých vláken pro typ vláken. Měřítko = 50 μm. C. Kvantifikace exprese nekódující RNA specifické pro typ myofiber, stanovená pomocí RNAscope (n = 3 biopsie od nezávislých jedinců, porovnávání rychlých a pomalých svalových vláken u každého jedince). Statistická analýza byla provedena pomocí oboustranného Studentova t-testu. Krabicové grafy ukazují medián a první a třetí kvartil, přičemž whiskery ukazují na minimální a maximální hodnoty. D. Pracovní postup de novo identifikace mikrobiálních proteinů (vytvořený pomocí BioRender.com). E. Mikrobiální protein LINC01405_ORF408:17441:17358 je specificky exprimován v pomalých kosterních svalových vláknech (n = 5 biopsií od nezávislých účastníků, porovnávání rychlých a pomalých svalových vláken u každého účastníka). Statistická analýza byla provedena s použitím Limmovy lineární modelové metody v kombinaci s empirickým Bayesovským přístupem, následované Benjaminiho-Hochbergovou metodou pro vícenásobné srovnání s úpravou p-hodnoty. Krabicové grafy znázorňují medián, první a třetí kvartil, přičemž whiskery ukazují na maximální/minimální hodnoty.
Nedávné studie ukázaly, že mnoho předpokládaných nekódujících transkriptů kóduje transkribované mikrobiální proteiny, z nichž některé regulují svalovou funkci.44, 55 Abychom identifikovali mikrobiální proteiny s potenciální specificitou pro typ vláken, prohledali jsme náš soubor dat o 1000 proteomech vláken pomocí vlastního souboru FASTA obsahujícího sekvence nekódujících transkriptů (n = 305) nalezených v souboru dat o 1000 transkriptomech vláken (obrázek 5D). Identifikovali jsme 197 mikrobiálních proteinů z 22 různých transkriptů, z nichž 71 bylo diferencovaně regulováno mezi pomalými a rychlými vlákny kosterního svalstva (doplňkový obrázek 9C a doplňková datová sada 16). U LINC01405 byly identifikovány tři produkty mikrobiálních proteinů, z nichž jeden vykazoval podobnou specificitu pro pomalá vlákna jako jeho transkript (obrázek 5E a doplňkový obrázek 9D). Identifikovali jsme tedy LINC01405 jako gen kódující mikrobiální protein specifický pro pomalá vlákna kosterního svalstva.
Vyvinuli jsme komplexní pracovní postup pro rozsáhlou proteomickou charakterizaci jednotlivých svalových vláken a identifikovali jsme regulátory heterogenity vláken ve zdravých stavech. Tento pracovní postup jsme aplikovali k pochopení toho, jak nemalinové myopatie ovlivňují heterogenitu vláken kosterního svalstva. Nemalinové myopatie jsou dědičná svalová onemocnění, která způsobují svalovou slabost a u postižených dětí se projevují řadou komplikací, včetně respiračních potíží, skoliózy a omezené pohyblivosti končetin. 19,20 Typicky u nemalinních myopatií vedou patogenní varianty v genech, jako je aktin alfa 1 (ACTA1), k převaze složení pomalu se sťahujících myofibril, ačkoli tento efekt je heterogenní. Jednou z významných výjimek je troponin T1 nemalinová myopatie (TNNT1), která má převahu rychlých vláken. Lepší pochopení heterogenity, která je základem dysregulace vláken kosterního svalstva pozorované u nemalinních myopatií, by tedy mohlo pomoci odhalit složitý vztah mezi těmito onemocněními a typem myofibril.
Ve srovnání se zdravými kontrolami (n=3 na skupinu) vykazovaly myofibrily izolované od pacientů s nemalinní myopatií s mutacemi v genech ACTA1 a TNNT1 výraznou atrofii nebo dystrofii myofibril (obrázek 6A, doplňková tabulka 3). To představovalo značné technické výzvy pro proteomickou analýzu kvůli omezenému množství dostupného materiálu. Navzdory tomu jsme byli schopni detekovat 2485 proteinů ve 272 kosterních myofibrilách. Po filtraci alespoň 1000 kvantifikovaných proteinů na vlákno bylo 250 vláken podrobeno následné bioinformatické analýze. Po filtraci bylo kvantifikováno průměrně 1573 ± 359 proteinů na vlákno (doplňkový obrázek 10A, doplňkové datové sady 17–18). Je pozoruhodné, že navzdory významnému zmenšení velikosti vláken byla hloubka proteomu u vzorků pacientů s nemalinní myopatií snížena pouze mírně. Zpracování těchto dat pomocí našich vlastních souborů FASTA (včetně nekódujících transkriptů) nám navíc umožnilo identifikovat pět mikrobiálních proteinů ve kosterních myofibrách pacientů s nemalinní myopatií (doplňkový soubor dat 19). Dynamický rozsah proteomu byl výrazně širší a celkové proteiny v kontrolní skupině dobře korelovaly s výsledky předchozí analýzy 1000 vlákenného proteomu (doplňkový obrázek 10B–C).
A. Mikroskopické snímky znázorňující atrofii nebo dystrofii vláken a převahu různých typů vláken na základě MYH u nemalinových myopatií (NM) ACTA1 a TNNT1. Měřítko = 100 μm. Pro zajištění reprodukovatelnosti barvení u pacientů s ACTA1 a TNNT1 byly tři biopsie pacientů obarveny dvakrát až třikrát (čtyři řezy na případ) před výběrem reprezentativních snímků. B. Poměry typů vláken u účastníků na základě MYH. C. Graf hlavních komponent (PCA) vláken kosterního svalstva u pacientů s nemalinovými myopatiemi a kontrolní skupiny. D. Vlákna kosterního svalstva od pacientů s nemalinovými myopatiemi a kontrolní skupiny promítnutá na graf PCA určený z 1000 analyzovaných vláken na obrázku 2. Například sopečné grafy porovnávající rozdíly mezi účastníky s nemalinovými myopatiemi ACTA1 a TNNT1 a kontrolní skupinou a mezi účastníky s nemalinovými myopatiemi ACTA1 a TNNT1. Barevné kruhy označují proteiny, které se významně lišily při π < 0,05, a tmavé tečky označují proteiny, které se významně lišily při FDR < 0,05. Statistická analýza byla provedena s použitím metody lineárního modelu Limma a empirických Bayesovských metod, následovaná úpravou p-hodnoty pro vícenásobná srovnání s použitím metody Benjaminiho-Hochberga. H. Analýza obohacení významně odlišně exprimovaných proteinů v celém proteomu a ve vláknech typu 1 a 2A. Statistická analýza byla provedena s použitím balíčku clusterProfiler a p-hodnot upravených metodou Benjaminiho-Hochberga. I, J. Grafy analýzy hlavních komponent (PCA) vybarvené pomocí termínů extracelulární matrix a mitochondriální genové ontologie (GO).
Protože nemalinové myopatie mohou ovlivnit podíl typů myofiber exprimujících MYH v kosterním svalu,19,20 jsme nejprve zkoumali typy myofiber exprimujících MYH u pacientů s nemalinovými myopatiemi a kontrolní skupiny. Typ myofiber jsme stanovili pomocí nezaujaté metody, která byla dříve popsaná pro test 1000 myofiber (doplňkové obrázky 10D–E), a opět se nám nepodařilo identifikovat čistá 2X myofiber (obrázek 6B). Pozorovali jsme heterogenní vliv nemalinových myopatií na typ myofiber, protože dva pacienti s mutacemi ACTA1 měli zvýšený podíl myofiber typu 1, zatímco dva pacienti s nemalinovou myopatií TNNT1 měli snížený podíl myofiber typu 1 (obrázek 6B). Exprese MYH2 a izoforem rychlých troponinů (TNNC2, TNNI2 a TNNT3) byla skutečně snížena u myopatií ACTA1-nemalin, zatímco exprese MYH7 byla snížena u myopatií TNNT1-nemalin (doplňkový obrázek 11A). To je v souladu s předchozími zprávami o heterogenním přepínání typů myofibril u myopatií nemalin.19,20 Tyto výsledky jsme potvrdili imunohistochemicky a zjistili jsme, že pacienti s myopatií ACTA1-nemalin měli převahu myofibril typu 1, zatímco pacienti s myopatií TNNT1-nemalin měli opačný vzorec (obrázek 6A).
Na úrovni proteomu jednotlivých vláken se vlákna kosterního svalstva od pacientů s nemalinovou myopatií ACTA1 a TNNT1 shlukovala s většinou kontrolních vláken, přičemž vlákna nemalinové myopatie TNNT1 byla obecně nejvíce postižena (obrázek 6C). To bylo obzvláště patrné při vykreslení grafů pseudoinflovaných vláken pomocí analýzy hlavních komponent (PCA) pro každého pacienta, přičemž pacienti s nemalinovou myopatií TNNT1 2 a 3 se jevili jako nejvíce vzdálení od kontrolních vzorků (doplňkový obrázek 11B, doplňková datová sada 20). Abychom lépe pochopili, jak se vlákna od pacientů s myopatií srovnávají se zdravými vlákny, použili jsme podrobné informace získané z proteomické analýzy 1 000 vláken od zdravých dospělých účastníků. Vlákna z datové sady o myopatii (pacienti s nemalinovou myopatií ACTA1 a TNNT1 a kontrolní skupina) jsme promítli na graf PCA získaný z proteomické analýzy 1000 vláken (obrázek 6D). Distribuce typů vláken MYH podél PC2 v kontrolních vláknech byla podobná distribuci vláken získané z proteomické analýzy 1000 vláken. Většina vláken u pacientů s nemalinovou myopatií se však posunula směrem dolů v PC2 a překrývala se se zdravými rychlými vlákny, bez ohledu na jejich nativní typ vláken MYH. Ačkoli tedy pacienti s nemalinovou myopatií ACTA1 vykazovali posun směrem k vláknům typu 1 při kvantifikaci pomocí metod založených na MYH, jak ACTA1 nemalinová myopatie, tak TNNT1 nemalinová myopatie posunuly proteom vláken kosterního svalstva směrem k rychlým vláknům.
Následně jsme přímo porovnali každou skupinu pacientů se zdravými kontrolami a identifikovali 256, respektive 552 rozdílně exprimovaných proteinů u nemalinových myopatií ACTA1 a TNNT1 (obrázek 6E–G a doplňkový obrázek 11C, doplňková datová sada 21). Analýza genového obohacení odhalila koordinovaný pokles mitochondriálních proteinů (obrázek 6H–I, doplňková datová sada 22). Překvapivě, navzdory rozdílné převaze typů vláken u nemalinových myopatií ACTA1 a TNNT1, byl tento pokles zcela nezávislý na typu vláken založeném na MYH (obrázek 6H a doplňkové obrázky 11D–I, doplňková datová sada 23). U nemalinových myopatií ACTA1 nebo TNNT1 byly regulovány také tři mikrobiální proteiny. Dva z těchto mikroproteinů, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (také známý jako LINC00598 nebo Lnc-FOXO1) a ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), vykazovaly rozdílnou hojnost pouze v myofibrách typu 1. Dříve bylo popsáno, že ENSG00000215483_TR14_ORF67 hraje roli v regulaci buněčného cyklu.56 Na druhou stranu, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (odpovídající LINC01798) byl zvýšen v myofibrách typu 1 i typu 2A u ACTA1-nemalinní myopatie ve srovnání se zdravými kontrolami (doplňkový obrázek 12A, doplňková datová sada 24). Naproti tomu ribozomální proteiny nebyly nemalinovou myopatií do značné míry ovlivněny, ačkoli RPS17 byl u nemalinové myopatie ACTA1 downregulován (obr. 6E).
Analýza obohacení také odhalila zvýšenou regulaci procesů imunitního systému u nemalinových myopatií ACTA1 a TNNT1, zatímco buněčná adheze byla také zvýšena u TNNT1 nemalinové myopatie (obrázek 6H). Obohacení těchto extracelulárních faktorů se odrazilo v posunu extracelulárních matrixových proteinů PCA v PC1 a PC2 negativním směrem (tj. směrem k nejvíce postiženým vláknům) (obrázek 6J). Obě skupiny pacientů vykazovaly zvýšenou expresi extracelulárních proteinů zapojených do imunitních odpovědí a mechanismů opravy sarkolemy, jako jsou anexiny (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 a jejich interagující protein S100A1159 (doplňkové obrázky 12B–C). Bylo dříve popsáno, že tento proces je zvýšený u svalových dystrofií60, ale podle našich znalostí nebyl dříve spojován s nemalinovými myopatiemi. Normální funkce tohoto molekulárního aparátu je nezbytná pro opravu sarkolemy po poranění a pro fúzi nově vytvořených myocytů s myoflaken58,61. Zvýšená aktivita tohoto procesu v obou skupinách pacientů tedy naznačuje reparativní reakci na poškození způsobené nestabilitou myofiber.
Účinky každé nemalinové myopatie byly dobře korelované (r = 0,736) a vykazovaly rozumný překryv (doplňkové obrázky 11A–B), což naznačuje, že nemalinová myopatie ACTA1 a TNNT1 mají podobné účinky na proteom. Některé proteiny však byly regulovány pouze u nemalinové myopatie ACTA1 nebo TNNT1 (doplňkové obrázky 11A a C). Profibrotický protein MFAP4 byl jedním z nejvíce upregulovaných proteinů u nemalinové myopatie TNNT1, ale u nemalinové myopatie ACTA1 zůstal nezměněn. SKIC8, složka komplexu PAF1C zodpovědná za regulaci transkripce genu HOX, byla u nemalinové myopatie TNNT1 downregulována, ale u nemalinové myopatie ACTA1 nebyla ovlivněna (doplňkový obrázek 11A). Přímé srovnání nemalinové myopatie ACTA1 a TNNT1 odhalilo větší snížení mitochondriálních proteinů a zvýšení proteinů imunitního systému u nemalinové myopatie TNNT1 (obrázek 6G–H a doplňkové obrázky 11C a 11H–I). Tato data jsou v souladu s větší atrofií/dystrofií pozorovanou u nemalinové myopatie TNNT1 ve srovnání s nemalinovou myopatií TNNT1 (obrázek 6A), což naznačuje, že nemalinová myopatie TNNT1 představuje závažnější formu onemocnění.
Abychom posoudili, zda pozorované účinky nemalinové myopatie přetrvávají na úrovni celého svalu, provedli jsme hromadnou proteomickou analýzu svalových biopsií od stejné kohorty pacientů s nemalinovou myopatií TNNT1 a porovnali je s kontrolní skupinou (n=3 na skupinu) (doplňkový obrázek 13A, doplňková datová sada 25). Jak se očekávalo, kontrolní skupina si byla v analýze hlavních komponent úzce spjata, zatímco pacienti s nemalinovou myopatií TNNT1 vykazovali vyšší variabilitu mezi vzorky, podobnou té, která byla pozorována při analýze jednotlivých vláken (doplňkový obrázek 13B). Hromadná analýza reprodukovala diferencovaně exprimované proteiny (doplňkový obrázek 13C, doplňková datová sada 26) a biologické procesy (doplňkový obrázek 13D, doplňková datová sada 27) zvýrazněné porovnáním jednotlivých vláken, ale ztratila schopnost rozlišovat mezi různými typy vláken a nezohlednila heterogenní účinky onemocnění napříč vlákny.
Tato data dohromady ukazují, že proteomika jednotlivých myofilaken může objasnit klinické biologické znaky, které nejsou detekovatelné cílenými metodami, jako je imunoblotting. Tato data navíc zdůrazňují omezení použití samotné typizace aktinových vláken (MYH) k popisu fenotypové adaptace. Ačkoli se přepínání typů vláken u aktinových a troponinových nemalinových myopatií liší, obě nemalinové myopatie oddělují typizaci MYH vláken od metabolismu vláken kosterního svalstva směrem k rychlejšímu a méně oxidativnímu svalovému proteomu.
Buněčná heterogenita je zásadní pro to, aby tkáně splňovaly své rozmanité požadavky. V kosterním svalu se to často popisuje jako typy vláken charakterizované různým stupněm produkce síly a únavy. Je však zřejmé, že to vysvětluje pouze malou část variability vláken kosterního svalstva, která je mnohem variabilnější, komplexnější a mnohostrannější, než se dříve myslelo. Technologický pokrok nyní osvětlil faktory regulující vlákna kosterního svalstva. Naše data skutečně naznačují, že vlákna typu 2X nemusí být samostatným podtypem vláken kosterního svalstva. Navíc jsme identifikovali metabolické proteiny, ribozomální proteiny a proteiny asociované s buňkami jako hlavní determinanty heterogenity vláken kosterního svalstva. Aplikací našeho proteomického pracovního postupu na vzorky pacientů s myopatií hlístic jsme dále prokázali, že typizace vláken založená na MYH plně neodráží heterogenitu kosterního svalstva, zejména pokud je systém narušen. Bez ohledu na typ vláken založenou na MYH vede myopatie hlístic k posunu směrem k rychlejším a méně oxidativním vláknům.
Vlákna kosterního svalstva jsou klasifikována od 19. století. Nedávné omické analýzy nám umožnily začít chápat expresní profily různých typů vláken MYH a jejich reakce na různé podněty. Jak je zde popsáno, omické přístupy mají také výhodu větší citlivosti pro kvantifikaci markerů typu vláken než tradiční metody založené na protilátkách, aniž by se musely spoléhat na kvantifikaci jednoho (nebo několika) markerů pro definování typu vláken kosterního svalstva. Použili jsme komplementární transkriptomické a proteomické pracovní postupy a integrovali výsledky k prozkoumání transkripční a posttranskripční regulace heterogenity vláken ve vláknech lidského kosterního svalstva. Tento pracovní postup vedl k neschopnosti identifikovat čistá vlákna typu 2X na úrovni proteinů v vastus lateralis naší kohorty zdravých mladých mužů. To je v souladu s předchozími studiemi jednotlivých vláken, které zjistily <1 % čistých 2X vláken ve zdravých vastus lateralis, ačkoli by to mělo být v budoucnu potvrzeno i u jiných svalů. Rozdíl mezi detekcí téměř čistých 2X vláken na úrovni mRNA a pouze smíšených 2A/2X vláken na úrovni proteinů je záhadný. Exprese mRNA izoformy MYH neprobíhá cirkadiánně,67 což naznačuje, že je nepravděpodobné, že bychom „přehlédli“ signál začátku MYH2 ve zdánlivě čistých 2X vláknech na úrovni RNA. Jedním z možných vysvětlení, i když čistě hypotetických, by mohly být rozdíly ve stabilitě proteinů a/nebo mRNA mezi izoformami MYH. Žádné rychlé vlákno skutečně není 100% čisté pro jakoukoli izoformu MYH a není jasné, zda by hladiny exprese mRNA MYH1 v rozmezí 70–90 % vedly ke stejnému množství MYH1 a MYH2 na úrovni proteinů. Při zvažování celého transkriptomu nebo proteomu však může shluková analýza s jistotou identifikovat pouze dva odlišné shluky představující pomalá a rychlá vlákna kosterního svalstva, bez ohledu na jejich přesné složení MYH. To je v souladu s analýzami využívajícími transkriptomické přístupy s jedním jádrem, které obvykle identifikují pouze dva odlišné myonukleární shluky. 68, 69, 70 Navíc, ačkoli předchozí proteomické studie identifikovaly vlákna typu 2X, tato vlákna se neshlukují odděleně od zbytku rychlých vláken a vykazují pouze malý počet odlišně hojných proteinů ve srovnání s jinými typy vláken založenými na MYH. 14 Tyto výsledky naznačují, že bychom se měli vrátit k pohledu na klasifikaci svalových vláken z počátku 20. století, který rozděloval lidská kosterní svalová vlákna nikoli do tří odlišných tříd na základě MYH, ale do dvou shluků na základě jejich metabolických a kontraktilních vlastností. 63
Ještě důležitější je, že heterogenita myofibril by měla být posuzována z hlediska více dimenzí. Předchozí „omické“ studie tímto směrem poukázaly a naznačují, že vlákna kosterního svalstva netvoří samostatné shluky, ale jsou uspořádána podél kontinua. 11, 13, 14, 64, 71 Zde ukazujeme, že kromě rozdílů v kontraktilních a metabolických vlastnostech kosterního svalstva lze myofibrilky rozlišit i podle znaků souvisejících s buněčnými interakcemi a translačními mechanismy. Ve vláknech kosterního svalstva jsme skutečně zjistili heterogenitu ribozomů, která přispívá k heterogenitě nezávisle na typech pomalých a rychlých vláken. Základní příčina této značné heterogenity myofibril, nezávislé na typu pomalých a rychlých vláken, zůstává nejasná, ale může ukazovat na specializovanou prostorovou organizaci ve svalových svazcích, které optimálně reagují na specifické síly a zátěže,72 specializovanou buněčnou nebo orgánově specifickou komunikaci s jinými typy buněk ve svalovém mikroprostředí73,74,75 nebo na rozdíly v aktivitě ribozomů v rámci jednotlivých myofibril. Bylo skutečně prokázáno, že ribozomální heteroplazmy, buď prostřednictvím paralogní substituce RPL3 a RPL3L, nebo na úrovni 2'O-methylace rRNA, jsou spojeny s hypertrofií kosterního svalstva76,77. Multiomické a prostorové aplikace v kombinaci s funkční charakterizací jednotlivých svalových vláken dále prohloubí naše chápání svalové biologie na multiomické úrovni78.
Analýzou proteomů jednotlivých myofiber od pacientů s nemalinovými myopatiemi jsme také prokázali užitečnost, účinnost a použitelnost proteomiky jednotlivých myofiber k objasnění klinické patofyziologie kosterního svalstva. Navíc porovnáním našeho pracovního postupu s globální proteomickou analýzou jsme byli schopni prokázat, že proteomika jednotlivých myofiber poskytuje stejnou hloubku informací jako globální tkáňová proteomika a tuto hloubku rozšiřuje zohledněním heterogenity mezi vlákny a typu myofiber. Kromě očekávaných (i když variabilních) rozdílů v poměru typů vláken pozorovaných u nemalinových myopatií ACTA1 a TNNT1 ve srovnání se zdravými kontrolami,19 jsme také pozorovali oxidativní a extracelulární remodelaci nezávislou na přepínání typů vláken zprostředkovaném MYH. Fibróza byla dříve hlášena u nemalinových myopatií TNNT1.19 Naše analýza však na tomto zjištění staví tím, že odhaluje také zvýšené hladiny extracelulárně sekretovaných proteinů souvisejících se stresem, jako jsou anexiny, které se podílejí na mechanismech opravy sarkolemy, v myofibrách pacientů s nemalinovými myopatiemi ACTA1 a TNNT1.57,58,59 Závěrem lze říci, že zvýšené hladiny anexinu v myofibrách pacientů s nemalinovou myopatií mohou představovat buněčnou reakci na opravu těžce atrofických myofibril.
Ačkoli tato studie představuje dosud největší analýzu omik jednotlivých vláken u lidí, není bez omezení. Vlákna kosterního svalstva jsme izolovali z relativně malého a homogenního vzorku účastníků a jednoho svalu (musculus vastus lateralis). Proto není možné vyloučit existenci specifických populací vláken napříč typy svalů a v extrémních fázích svalové fyziologie. Nemůžeme například vyloučit možnost vzniku podskupiny ultrarychlých vláken (např. čistě 2X vláken) u vysoce trénovaných sprinterů a/nebo silových sportovců79 nebo během období svalové nečinnosti66,80. Omezená velikost vzorku účastníků nám navíc zabránila ve zkoumání pohlavních rozdílů v heterogenitě vláken, protože je známo, že poměry typů vláken se u mužů a žen liší. Navíc jsme nebyli schopni provést transkriptomické a proteomické analýzy na stejných svalových vláknech ani ve vzorcích od stejných účastníků. Vzhledem k tomu, že my i další pokračujeme v optimalizaci analýz jednotlivých buněk a jednotlivých myofiber pomocí omické analýzy k dosažení ultranízkého vstupního množství vzorku (jak je zde prokázáno v analýze vláken od pacientů s mitochondriální myopatií), stává se zřejmou možnost kombinovat multi-omické (a funkční) přístupy v rámci jednotlivých svalových vláken.
Celkově naše data identifikují a vysvětlují transkripční a posttranskripční faktory ovlivňující heterogenitu kosterního svalstva. Konkrétně prezentujeme data, která zpochybňují dlouholeté dogma ve fyziologii kosterního svalstva spojené s klasickou definicí typů vláken založenou na myotrofickém hysteropatii (MYH). Doufáme, že obnovíme debatu a nakonec přehodnotíme naše chápání klasifikace a heterogenity vláken kosterního svalstva.
Čtrnáct účastníků bělošské rasy (12 mužů a 2 ženy) dobrovolně souhlasilo s účastí v této studii. Studie byla schválena etickou komisí Univerzitní nemocnice v Gentu (BC-10237), splňovala požadavky Helsinské deklarace z roku 2013 a byla registrována na ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Obecná charakteristika účastníků je uvedena v doplňkové tabulce 1. Po získání ústního a písemného informovaného souhlasu se účastníci před konečným zařazením do studie podrobili lékařskému vyšetření. Účastníci byli mladí (22–42 let), zdraví (bez zdravotních potíží, bez anamnézy kouření) a středně fyzicky aktivní. Maximální příjem kyslíku byl stanoven pomocí stepového ergometru pro posouzení fyzické zdatnosti, jak bylo popsáno dříve. 81
Vzorky svalové biopsie byly odebrány třikrát v klidu a nalačno s odstupem 14 dnů. Protože tyto vzorky byly odebrány v rámci rozsáhlejší studie, účastníci konzumovali 40 minut před biopsií placebo (laktózu), antagonistu H1-receptorů (540 mg fexofenadinu) nebo antagonistu H2-receptorů (40 mg famotidinu). Již dříve jsme prokázali, že tito antagonisté histaminových receptorů neovlivňují klidovou fyzickou zdatnost kosterního svalstva81 a v našich grafech kontroly kvality nebyla pozorována žádná shlukování související se stavem (doplňkové obrázky 3 a 6). Standardizovaná strava (41,4 kcal/kg tělesné hmotnosti, 5,1 g sacharidů/kg tělesné hmotnosti, 1,4 g bílkovin/kg tělesné hmotnosti a 1,6 g tuku/kg tělesné hmotnosti) byla udržována 48 hodin před každým experimentálním dnem a ráno v experimentální den byla konzumována standardizovaná snídaně (1,5 g sacharidů/kg tělesné hmotnosti). V místním znecitlivění (0,5 ml 1% lidokainu bez adrenalinu) byly odebrány svalové biopsie z m. vastus lateralis pomocí perkutánní Bergströmovy aspirace.82 Vzorky svalů byly okamžitě zality do RNAlater a skladovány při 4 °C do manuální disekce vláken (až 3 dny).
Čerstvě izolované svazky myofiber byly přeneseny do čerstvého média RNAlater v kultivační misce. Jednotlivá myofibre byla poté ručně preparována pomocí stereomikroskopu a jemné pinzety. Z každé biopsie bylo preparováno dvacet pět vláken, přičemž zvláštní pozornost byla věnována výběru vláken z různých oblastí biopsie. Po preparaci bylo každé vlákno jemně ponořeno do 3 μl lyzačního pufru (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) obsahujícího proteinázu K a enzymy DNázu, aby se odstranily nežádoucí proteiny a DNA. Lýza buněk a odstranění proteinů/DNA byly poté zahájeny krátkým vortexováním, odstředěním kapaliny v mikrocentrifuze a inkubací při pokojové teplotě (10 min). Lyzát byl poté inkubován v termocykleru (T100, Bio-Rad) při 37 °C po dobu 5 minut, 75 °C po dobu 5 minut a poté ihned uložen při -80 °C do dalšího zpracování.
Knihovny polyadenylované RNA kompatibilní s Illuminou byly připraveny ze 2 µl lyzátu myofiber za použití sady QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Podrobné metody lze nalézt v návodu k použití od výrobce. Proces začíná syntézou cDNA prvního řetězce reverzní transkripcí, během níž se zavedou unikátní molekulární identifikátory (UMI) a čárové kódy i1 specifické pro daný vzorek, aby se zajistilo sloučení vzorků a snížila se technická variabilita během následného zpracování. cDNA z 96 myofiber se poté sloučí a purifikuje magnetickými kuličkami, načež se RNA odstraní a provede se syntéza druhého řetězce za použití náhodných primerů. Knihovna se purifikuje magnetickými kuličkami, přidají se specifické značky i5/i7 a amplifikuje se pomocí PCR. Posledním krokem purifikace jsou knihovny kompatibilní s Illuminou. Kvalita každého poolu knihoven byla posouzena za použití sady High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Na základě kvantifikace pomocí Qubitů byly pooly dále sloučeny v ekvimolárních koncentracích (2 nM). Výsledný pool byl poté sekvenován na přístroji NovaSeq 6000 ve standardním režimu s použitím reagenční soupravy NovaSeq S2 (1 × 100 nukleotidů) s náplní 2 nM (4% PhiX).
Náš proces je založen na datovém analytickém nástroji Lexogen QuantSeq Pool (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Data byla nejprve demultiplexována pomocí bcl2fastq2 (v2.20.0) na základě indexu i7/i5. Druhý čtený záznam byl poté demultiplexován pomocí idemux (v0.1.6) na základě čárového kódu vzorku i1 a sekvence UMI byly extrahovány pomocí umi_tools (v1.0.1). Čtené záznamy byly poté v několika kolech oříznuty pomocí cutadapt (v3.4), aby se odstranily krátké záznamy (délka <20) nebo záznamy sestávající pouze z adaptorových sekvencí. Záznamy byly poté zarovnány s lidským genomem pomocí STAR (v2.6.0c) a soubory BAM byly indexovány pomocí SAMtools (v1.11). Duplicitní záznamy byly odstraněny pomocí umi_tools (v1.0.1). Nakonec bylo provedeno počítání zarovnání pomocí featureCounts v Subread (v2.0.3). Kontrola kvality byla provedena pomocí FastQC (v0.11.9) v několika mezifázích procesu.
Veškeré další bioinformatické zpracování a vizualizace byly provedeny v R (v4.2.3), primárně s využitím pracovního postupu Seurat (v4.4.0).83 Proto byly jednotlivé hodnoty UMI a matice metadat transformovány do objektů Seurat. Geny exprimované v méně než 30 % všech vláken byly odstraněny. Vzorky nízké kvality byly odstraněny na základě minimálního prahu 1000 hodnot UMI a 1000 detekovaných genů. Nakonec 925 vláken prošlo všemi kroky filtrování kontroly kvality. Hodnoty UMI byly normalizovány pomocí metody Seurat SCTransform v2,84 včetně všech 7418 detekovaných znaků, a rozdíly mezi účastníky byly regresně vyloučeny. Všechna relevantní metadata lze nalézt v doplňkové datové sadě 28.
Čas zveřejnění: 10. září 2025