Děkujeme za návštěvu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepších výsledků doporučujeme použít novější verzi vašeho prohlížeče (nebo zakázat režim kompatibility v Internet Explorer). Mezitím, abychom zajistili pokračující podporu, zobrazujeme web bez stylu nebo JavaScriptu.
Mikrobiální růst ran se často projevuje jako biofilmy, které narušují hojení a je obtížné eradikovat. Nové stříbrné obvazy tvrdí, že bojují proti infekcím rány, ale jejich účinnost antibiofilmu a účinky hojení nezávislé na infekci jsou obecně neznámé. Použitím biofilmových modelů in vitro a in vivo stafylococcus aureus a pseudomonas aeruginosa uvádíme účinnost obvazů generujících ionty Ag1+; Ag1+ obvazy obsahující kyselinu ethylendiaminetetraoctovou a benzetoniumchlorid (Ag1+/EDTA/BC) a obvazy obsahující dusičnan stříbrné (Ag Oxysats). , které produkují ionty Ag1+, Ag2+ a Ag3+ pro boj proti biofilmu rány a jeho účinku na hojení. Obvazy Ag1+ měly minimální účinky na biofilm rány in vitro a u myší (C57BL/6J). Naproti tomu okysličené ag soli a obvazy Ag1+/EDTA/BC významně snížily počet životaschopných bakterií v biofilmech in vitro a prokázaly významné snížení bakteriálních a EPS složek v biofilmech myších ran. Tyto obvazy měly odlišné účinky na hojení rány infikovaných biofilmem a nebiofilm infikovaných rány, přičemž okysličené solné obvazy měly příznivější účinky na reepitelializaci, velikost rány a zánět ve srovnání s kontrolními léčbami a dalšími stříbrnými dres. Různé fyzikálně-chemické vlastnosti stříbrných obvazů mohou mít různé účinky na biofilm a hojení rány, a to by mělo být zváženo při výběru obvazu pro zpracování rány infikovaných biofilmem.
Chronické rány jsou definovány jako „rány, které nedokážou postupovat v normálních stádiích hojení řádně a včas“ 1. Chronické rány vytvářejí psychologickou, sociální a ekonomickou zátěž pro pacienty a systém zdravotní péče. Roční výdaje NHS za léčbu ran a souvisejících komorbidit se v letech 2017–182 odhadují na 8,3 miliardy GBP. Chronické rány jsou také v současné době ve Spojených státech naléhavým problémem, přičemž Medicare odhaduje roční náklady na léčbu pacientů s ranami na 28,1–96,8 miliardy USD3.
Infekce je hlavním faktorem, který brání hojení ran. Infekce se často projevují jako biofilmy, které jsou přítomny u 78% neléčivých chronických ran. Biofilmy se vytvářejí, když se mikroorganismy nevratně připojí k povrchům, jako jsou povrchy rány, a mohou se agregovat za vzniku komunit produkujících extracelulární polymer (EPS). Biofilm rány je spojen se zvýšenou zánětlivou odpovědí vedoucí k poškození tkáně, což může zpozdit nebo zabránit hojení4. Zvýšení poškození tkáně může být částečně způsobeno zvýšenou aktivitou metaloproteináz matrice, kolagenázy, elastázy a reaktivního druhu kyslíku5. Kromě toho jsou zánětlivé buňky a biofilmy samy o sobě vysokými spotřebiteli kyslíku, a proto mohou způsobit hypoxii lokální tkáně, vyčerpávající buňky vitálního kyslíku potřebného pro efektivní opravu tkáně6.
Zralé biofilmy jsou vysoce rezistentní vůči antimikrobiálním látkám, což vyžaduje agresivní strategie pro kontrolu infekcí biofilmu, jako je mechanická léčba, po které následuje účinná antimikrobiální léčba. Protože biofilmy se mohou rychle regenerovat, mohou účinné antimikrobiální látky snížit riziko re-formace po chirurgickém debridementu7.
Stříbro se stále více používá v antimikrobiálních obvazech a často se používá jako léčba první linie chronických infikovaných ran. Existuje mnoho komerčně dostupných stříbrných obvazů, z nichž každá obsahuje jiné stříbrné složení, koncentraci a základní matrici. Pokroky ve stříbrných náramcích vedly k vývoji nových stříbrných náramků. Kovová forma stříbra (AG0) je inertní; K dosažení antimikrobiální účinnosti musí ztratit elektron, aby vytvořil iontové stříbro (AG1+). Tradiční stříbrné obvazy obsahují stříbrné sloučeniny nebo kovové stříbro, které, když jsou vystaveny kapalině, se rozkládají za vzniku iontů Ag1+. Tyto ionty Ag1+ reagují s bakteriální buňkou, odstraňují elektrony ze strukturálních složek nebo kritických procesů nezbytných pro přežití. Patentovaná technologie vedla k vývoji nové stříbrné sloučeniny, Ag oxysalty (stříbrný dusičnan, Ag7no11), která je zahrnuta do obvazů rány. Na rozdíl od tradičního stříbra vytváří rozklad soli obsahujících kyslík stavy stříbra s vyšší valencí (Ag1+, Ag2+a Ag3+). Studie in vitro ukázaly, že nízké koncentrace okysličených stříbrných solí jsou účinnější než jednotlivé iontové stříbro (AG1+) proti patogenním bakteriím, jako jsou Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus a Escherichia coli8,9. Další nový typ stříbrného obvazu zahrnuje další složky, jmenovitě kyselina ethylendiaminetetraoctová (EDTA) a benzethoniumchlorid (BC), o nichž se uvádí, že cílí na biofilmové EPS, a tím zvyšuje pronikání stříbra do biofilmu. Tyto nové stříbrné technologie nabízejí nové způsoby cílení na biofilmy rány. Dopad těchto antimikrobiálních látek na prostředí rány a hojení nezávislé na infekci je však důležité, aby se zajistilo, že nevytvářejí nepříznivé prostředí rány nebo zpoždění hojení. Obavy o in vitro stříbrné cytotoxicitě byly hlášeny u několika stříbrných dresinků10,11. Avšak in vitro cytotoxicita dosud neprokázala toxicitu in vivo a několik obvazů Ag1+ prokázalo dobrý bezpečnostní profil12.
Zde jsme zkoumali účinnost karboxymethylcelulózových obvazů obsahujících nové stříbrné formulace proti biofilmu rány in vitro a in vivo. Kromě toho byly hodnoceny účinky těchto obvaz na imunitní odpovědi a léčení nezávislé na infekci.
Všechny použité obvazy byly komerčně dostupné. 3M Kerracel Gel Fiber Dresing (3M, Knutsford, Velká Británie) je ne-antimikrobiální 100% karboxymethylcelulóza (CMC) dresink, který byl v této studii použit jako kontrolní obvaz. Byly vyhodnoceny tři antimikrobiální stříbrné obvazy CMC, jmenovitě 3M dresink Kerracel Ag (3M, Knutsford, Velká Británie), který obsahuje 1,7%hmotn. Oxygenovaná stříbrná sůl (AG7NO11) ve vyšších valenčních stříbrných iontů (AG1+, AG2+a AG3+). Během rozkladu AG7NO11 jsou ionty Ag1+, Ag2+ a Ag3+ tvořeny v poměru 1: 2: 4. Obvaz Aquacel Ag obsahující 1,2% stříbrný chlorid (AG1+) (Connatec, Deeside, UK) 13 a Aquacel Ag+Extra Dreak obsahující 1,2% stříbrný chlorid (AG1+), EDTA a Benzetoniumchlorid (Convatec, Deeside, Velká Británie) 14.
Kmeny použité v této studii byly Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) a Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterie byly pěstovány přes noc ve vývaru Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Velká Británie). Kultura přes noc byla poté zředěna 1: 100 v vývaru Mueller-Hinton a 200 ul naneseno na sterilní 0,2 µm Whatman Cyclopore Membrány (Whatman Plc, Maidstone, Velká Británie) na Mueller-Hinton Agar Destičky (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Velká Británie ). ) Tvorba koloniálního biofilmu při 37 ° C po dobu 24 hodin. Tyto koloniální biofilmy byly testovány na logaritmické smrštění.
Nakrájejte na obvaz na 3 cm2 čtvercové kusy a předmocí se sterilní deionizovanou vodou. Umístěte obvaz přes biofilm kolonie na desku agaru. Každých 24 ha biofilmu bylo odstraněno a životaschopné bakterie v biofilmu (CFU/ml) byly kvantifikovány sériovým ředěním (10–1 až 10–7) v neutralizačním vývaru denního úhlu (Merck-Millipore). Po 24 hodinách inkubace při 37 ° C byl prováděn standardní počet destiček na agarových destičkách Mueller-Hinton. Každé ošetření a časový bod byly provedeny trojmo a pro každé zředění se opakovalo počet destiček.
Vepřová břichová kůže se získává od ženských velkých bílých prasat do 15 minut po porážce v souladu s vývozními standardy Evropské unie. Kůže byla oholena a vyčištěna s ubrousky alkoholu a poté zmrazena při -80 ° C po dobu 24 hodin, aby se kůže devitalizovala. Po rozmrazení byly kousky kůže 1 cm2 promyty třikrát PBS, 0,6% chlornanem sodným a 70% ethanolem pokaždé po dobu 20 minut. Před odstraněním epidermis odstraňte jakýkoli zbývající ethanol promytím 3krát ve sterilním PBS. Kůže byla kultivována na 6-jamkové destičce s nylonovou membránou o tloušťce 0,45 μm (Merck-Millipore) na vrcholu a 3 absorpční polštářky (Merck-Millipore) obsahující 3 ml fetálního hovězího séra (SIGMA) doplněné 10% Dulbecco's Modified Modified's Modified's Modified's Modified's Modified's Modified Orel. Střední (Dulbecco's Modified Eagle Medium - Aldrich Ltd.).
Koloniální biofilmy byly pěstovány, jak je popsáno pro studie expozice biofilmu. Po kultivaci biofilmu na membráně po dobu 72 hodin byl biofilm aplikován na povrch kůže pomocí sterilní inokulační smyčky a membrána byla odstraněna. Biofilm byl poté inkubován na dermis prasečích po dobu dalších 24 hodin při 37 ° C, aby biofilm zrát a přilnil na kůži prasete. Poté, co biofilm vyzrál a připevněn, byl obvaz 1,5 cm2, předem zamožen sterilní destilovanou vodou, nanesen přímo na povrch kůže a inkubován při 37 ° C po dobu 24 hodin. Životní bakterie byly vizualizovány barvením rovnoměrným použitím činidla životaschopnosti Prestoblue buněk (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Velká Británie) na apikální povrch každého explantátu a inkubací po dobu 5 minut. Pomocí digitálního fotoaparátu Leica DFC425 okamžitě zachytí obrázky na mikroskopu Leica MZ8. Oblasti barevná růžová byla kvantifikována pomocí softwaru Image Pro Version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (MediaCy.com)). Skenovací elektronová mikroskopie byla provedena, jak je popsáno níže.
Bakterie pěstované přes noc byly zředěny 1: 100 v Mueller-Hintonově vývaru. 200 ul kultury bylo přidáno do sterilní 0,2 μm Whatman Cyclopore membrány (Whatman, Maidstone, Velká Británie) a naneseno na Mueller-Hinton Agar. Biofilmové destičky byly inkubovány při 37 ° C po dobu 72 hodin, aby se umožnila tvorba zralého biofilmu.
Po 3 dnech zrání biofilmu byl obvaz 3 cm2 čtvereční umístěn přímo na biofilm a inkubován při 37 ° C po dobu 24 hodin. Po odstranění obvazu z povrchu biofilmu bylo na povrch každého biofilmu přidáno 1 ml reagen pro životaschopnost Prestoblue (Invitrogen, Waltham, MA). Povrchy byly sušeny před zaznamenáním změn barvy pomocí digitálního fotoaparátu Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Velká Británie).
Připravte si přes noc kultury na agaru Mueller-Hinton, přeneste jednotlivé kolonie na 10 ml vývaru Mueller-Hinton a inkubujte na třepačce při 37 ° C (100 ot / min). Po inkubaci přes noc byla kultura zředěna 1: 100 v vývaru Mueller-Hinton a 300 ul bylo spatřeno na 0,2 um kruhové membrány Whatman Cyclopore (Whatman International, Maidstone, Velká Británie) na Mueller-Hinton Agar a inkubováno při 37 ° C během 72 hodin do 72 hodin do 72 hodin C. . . Zralý biofilm byl aplikován na ránu, jak je popsáno níže.
Veškerá práce se zvířaty byla prováděna na University of Manchester na základě projektové licence schválené Úřadem pro péči o péči o zvířata a etickým přezkumem (str. 8721bd27) a v souladu s pokyny zveřejněnými domácím úřadem v rámci revidované ASPA 2012. Všichni autoři dodržovali pokyny pro příchod. Pro všechny studie in vivo byly použity osmtýdenní myši C57BL/6J (Envigo, Oxon, UK). Myši byly anestetizovány isofluranem (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Velká Británie) a jejich hřbetní povrchy byly oholeny a vyčištěny. Každá myš dostala excizní ránu 2 × 6 mm pomocí úderu Biopsie Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Velká Británie). U ran infikovaných biofilmem aplikujte 72hodinový koloniální biofilm pěstovaný na membráně, jak je popsáno výše, na dermální vrstvu rány pomocí sterilní inokulační smyčky ihned po poranění a zlikvidujte membránu. Jeden čtvercový centimetr obvazu je předem zamožen sterilní vodou, aby se udržovalo vlhké prostředí rány. Obvazy byly aplikovány přímo na každou ránu a pokryty filmem 3M Tegaderm (3M, Bracknell, Velká Británie) a Mastisol Liquid Adhesive (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI), které se nacházejí kolem okrajů, aby poskytovaly další adhezi. Buprenorfin (Animalcare, York, Velká Británie) byl podáván v koncentraci 0,1 mg/kg jako analgetikum. Under myši tři dny po zranění pomocí metody plánu 1 a odstranění, poloviny a podle potřeby uložte oblast rány.
Podle protokolu výrobce bylo provedeno hematoxylin (Thermofisher Scientific) a eosin (Thermofisher Scientific). Oblast rány a reepitelializace byly kvantifikovány pomocí Image Pro Software verze 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Tkáňové řezy byly dewaxovány v xylenu (Thermofisher Scientific, Loughborough, Velká Británie), rehydratovány 100–50% odstupňovaným ethanolem a krátce ponořeny do deionizované vody (Thermofisher Scientific). Imunohistochemie byla provedena pomocí soupravy Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) podle protokolu výrobce. Primární protilátky jako neutrofily NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) a makrofágy MS CD107B Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Velká Británie) byly zředěny 1: 100 v blokovacím roztoku a přidány na řezaný povrch, následované 2 protilátkami proti-, VectaStain Substrátová souprava ABC a vektorová nova red peroxidáza (HRP) (vektorové laboratoře, burlingame, ca) a kontrastně barvená hematoxylinem. Obrázky byly získány pomocí mikroskopu Olympus BX43 a digitálního fotoaparátu Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Velká Británie).
Vzorky kůže byly fixovány v 2,5% glutaraldehydu a 4% formaldehydu v 0,1 M HEPES (pH 7,4) po dobu 24 hodin při 4 ° C. Vzorky byly dehydratovány pomocí odstupňovaného ethanolu a sušeny v CO2 pomocí kritického bodového sušičky kvora K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Velká Británie) a rozprašováním slitinou zlatý-paladium za použití systému kvora SC7620 Mini Spaterer/Glow propuštění. Vzorky byly zobrazeny pomocí skenovacího elektronového mikroskopu FEI quata 250 (Thermofisher Scientific) pro vizualizaci centrálního bodu rány.
ITO-1 jodid (2 μM) byl aplikován na povrch vyříznuté myši a inkubován po dobu 5 minut při 37 ° C (Thermofisher Scientific) a ošetřen SYTO-60 (10 μM) při 37 ° C (Thermofisher Scientific). 15minutové obrázky Z-stack byly vytvořeny pomocí Leica TCS SP8.
Biologická a technická replikační data byla tabulka a analyzována pomocí softwaru GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Jednosměrná analýza rozptylu s vícenásobným srovnáváním pomocí Dunnettova post hoc testu byla použita k testování rozdílů mezi každou léčbou a ne-antimikrobiálním kontrolním obvazem. Hodnota p <0,05 byla považována za významnou.
Účinnost vláknitých dresinků stříbrného gelu byla poprvé posouzena proti biofilmovým koloniím Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa in vitro. Stříbrné obvazy obsahují různé vzorce stříbra: tradiční stříbrné obvazy produkují ionty AG1+; Stříbrné obvazy, které mohou po přidání EDTA/BC produkovat ionty Ag1+, mohou zničit matici biofilmu a vystavit bakterie stříbro pod antibakteriálním účinkem stříbra. IONS15 a obvazy obsahující okysličené ag soli, které produkují ionty Ag1+, Ag2+ a Ag3+. Jeho účinnost byla porovnána s ne-antimikrobiálním kontrolním obvazem vyrobeným z gelových vláken. Zbývající životaschopné bakterie v biofilmu byly hodnoceny každých 24 hodin po dobu 8 dnů (obrázek 1). V den 5 byl biofilm znovu opětovný s 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus nebo 1,22 × 105p. Aeruginosa pro posouzení zotavení biofilmu. Ve srovnání s ne-antimikrobiálními kontrolními dresinami měly obvazy AG1+ minimální účinek na životaschopnost bakteriální v biofilmech Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa po dobu 5 dnů. Naproti tomu obvazy obsahující okysličené AG a AG1 + + EDTA/BC soli byly účinné při zabíjení bakterií v biofilmu do 5 dnů. Po opakované inokulaci s planktonickými bakteriemi v den 5 nebylo pozorováno žádné obnovení biofilmu (obr. 1).
Kvantifikace životaschopných bakterií v biofilmech Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa po ošetření stříbrnými dresinami. Biofilmové kolonie Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa byly ošetřeny stříbrnými dresinami nebo ne-antimikrobiálními kontrolními dresinami a počet zbývajících bakterií byl stanoven každých 24 hodin. Po 5 dnech byl biofilm znovu opěřen 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus nebo 1,22 × 105p. Kolonie bakterioplanktonu pseudomonas aeruginosa byly vytvořeny individuálně pro posouzení zotavení biofilmu. Grafy ukazují průměr +/- Standardní chyba.
Pro vizualizaci účinku stříbrných obvazů na životaschopnost biofilmu byly obvazy aplikovány na zralé biofilmy pěstované na prasečí kůži ex vivo. Po 24 hodinách je obvaz odstraněn a biofilm je obarven modrým reaktivním barvivem, které je metabolizováno živými bakteriemi na růžovou barvu. Biofilmy ošetřené kontrolními obvazy byly růžové, což ukazuje na přítomnost životaschopných bakterií v biofilmu (obrázek 2a). Naproti tomu biofilm ošetřený obvazem oxysolů Ag byl primárně modrý, což naznačuje, že zbývající bakterie na povrchu kůže prasat byly neživotné bakterie (obrázek 2B). Smíšené modré a růžové zbarvení bylo pozorováno v biofilmech ošetřených obvazly obsahujícími AG1+, což ukazuje na přítomnost životaschopných a neživotatelných bakterií v biofilmu (obrázek 2C), zatímco obvazy EDTA/BC obsahující AG1+ byly převážně modré s některými růžovými skvrnami. označující oblasti, které nejsou ovlivněny stříbrným obvazem (obrázek 2D). Kvantifikace aktivních (růžových) a neaktivních (modrých) oblastí ukázala, že kontrolní náplast byla 75% aktivní (obrázek 2E). Obvazy AG1 + + EDTA/BC se prováděly podobně jako okysličené solné obvazy Ag, s mírou přežití 13%, respektive 14%. Obvaz AG1+ také snížil životaschopnost bakterií o 21%. Tyto biofilmy byly poté pozorovány pomocí skenovací elektronové mikroskopie (SEM). Po ošetření kontrolním obvazem a obvazem AG1+ byla pozorována vrstva Pseudomonas aeruginosa, která pokrývala prasečí kůži (obrázek 2F, H), zatímco po ošetření obvazem AG1+ bylo nalezeno několik bakteriálních buněk a několik bakteriálních buněk bylo nalezeno. Kolagenová vlákna lze považovat za strukturu tkáně prasečí kůže (obrázek 2G). Po ošetření obvazem AG1 + + EDTA/BC byly viditelné bakteriální plaky a podkladové plaky kolagenových vláken (obrázek 2i).
Vizualizace biofilmu Pseudomonas aeruginosa po ošetření stříbrným obvazem. (A-D) Bakteriální životaschopnost v biofilmech Pseudomonas aeruginosa pěstovaných na prasečí kůži byla vizualizována pomocí Prestoblueho životaschopnosti barviva 24 hodin po ošetření stříbrnými obvazy nebo ne-antimikrobiálními kontrolními obvazy. Živé bakterie jsou růžové, neživotné bakterie a kůže prasat jsou modrá. (E) Kvantifikace biofilmů Pseudomonas aeruginosa pěstovaných na prasečí kůži (růžová skvrna) pomocí skenovací elektronové mikroskopie Image Pro verze 10 (FI) a ošetřena stříbrným dresinkem nebo ne-antimikrobiálním obvazem po dobu 24 hodin. SEM měřítko lišta = 5 µm. (J - M) Koloniální biofilmy rostly na filtrech a po 24 hodinách inkubace se stříbrnými obvazy byly obarveny reaktivním barvivem Prestoblue.
Aby se určilo, zda úzký kontakt mezi obvazy a biofilmy ovlivnil účinnost obvazů, byly koloniální biofilmy umístěné na rovném povrchu ošetřeny obvazy po dobu 24 hodin a poté obarveny reaktivními barvivy. Neošetřený biofilm byl tmavě růžový barvu (obrázek 2J). Na rozdíl od biofilmů ošetřených obvazů obsahujícími okysličené ag soli (obrázek 2K), biofilmy ošetřené obvazy obsahujícími Ag1+ nebo Ag1++ EDTA/BC vykazovaly pásy růžového barvení (obrázek 2L, M). Toto růžové zbarvení označuje přítomnost životaschopných bakterií a je spojena s oblastí šití v obvazu. Tyto šité oblasti vytvářejí mrtvé prostory, které umožňují bakteriím v biofilmu přežít.
Pro vyhodnocení účinnosti stříbrných obvazů in vivo byla plná tloušťka vyříznutá rány myší infikovaných zralými biofilmy S. aureus a P. aeruginosa ošetřena neantimikrobiálními regulačními obvazy nebo stříbrnými obvazy. Po 3 dnech léčby ukázala makroskopická analýza obrazu menší velikost rány, když byla léčena okysličenými solnými obvazy ve srovnání s ne-antimikrobiálními kontrolními dresinami a dalšími stříbrnými dresinami (obrázek 3A-H). Pro potvrzení těchto pozorování byla sklizena rány a oblast rány a reepitelializace byla kvantifikována na tkáňových řezech hematoxylinu a eosinu pomocí image Pro software verze 10 (obrázek 3i-l).
Účinek stříbrných obvazů na povrch rány a reepitelizaci ran infikovaných biofilmy. (A - H) Malé buňky infikované biofilmy Pseudomonas aeruginosa (A - D) a Staphylococcus aureus (E - H) po třech dnech léčby neantimikrobiálním kontrolním dresinkem, okysličeným agm solí, obvazem AG1+ obvaz a Ag1+ obvaz. Reprezentativní makroskopické obrazy. Rány myší s obvazem AG1 + + EDTA/BC. (IL) Reprezentativní infekce Pseudomonas aeruginosa, histologické řezy obarvené hematoxylinem a eosinem, používané k kvantifikaci oblasti rány a regeneraci epitelu. Kvantifikace oblasti rány (M, O) a procentní reepitelializace (n, p) zranění infikovaných biofilmy Pseudomonas aeruginosa (M, N) a Staphylococcus aureus (O, P) (na léčebnou skupinu N = 12). Grafy ukazují průměr +/- Standardní chyba. * znamená p = <0,05 ** znamená p = <0,01; Makroskopická stupnice = 2,5 mm, histologická stupnice = 500 µm.
Kvantifikace plochy rány u ran infikovaných biofilmem Pseudomonas aeruginosa (obrázek 3M) ukázalo, že rány ošetřované oxysaly ag měly průměrnou velikost rány 2,5 mm2, zatímco ne-antimikrobiální obvaz měl průměrnou velikost rány 3,1 mm2, což není, což není věrný. dosáhl statistické významnosti (obrázek 3M). P = 0,423). Rány ošetřené AG1+ nebo AG1++ EDTA/BC nevykazovaly žádné snížení plochy rány (3,1 mm2 a 3,6 mm2). Léčba okysličeným obvazem na soli Ag podporovala reepitelizaci ve větší míře než ne-antimikrobiální kontrolní obvaz (34% a 15%; P = 0,029) a Ag1+ nebo Ag1++ EDTA/BC (10% a 11%) (10% a 11%) ( Obrázek 3n). . , respektive).
Podobné trendy v oblasti rány a regenerace epitelu byly pozorovány u ran infikovaných biofilmy S. aureus (obrázek 3o). Obvazy obsahující okysličené stříbrné soli snížily plochu rány (2,0 mm2) o 23% ve srovnání s kontrolním ne-antimikrobiálním obvazem (2,6 mm2), ačkoli toto snížení nebylo významné (p = 0,304) (obr. 3O). Kromě toho byla oblast rány ve skupině AG1+ ošetřování mírně snížena (2,4 mm2), zatímco rána ošetřená obvazem AG1++ EDTA/BC nesnížila oblast rány (2,9 mm2). Kyslíkové soli AG také podporovaly re-epitelializaci ran infikovaných biofilmem S. aureus ve větší míře než u soli, které se léčily ne-antimikrobiálními kontrolními obvazy (12%, p = 0,003) (obrázek 3p). Obvaz Ag1+ (16%, p = 0,903) a Ag+ 1+ EDTA/BC obvaz (14%, p = 0,965) vykazoval hladiny regenerace epitelu podobné kontrole.
Pro vizualizaci účinku stříbrných obvazů na biofilmovou matrici bylo provedeno barvení Toto 1 a Syto 60 (obr. 4). Toto 1 jodid je barvivo, které lze použít k přesnému vizualizaci extracelulárních nukleových kyselin, které jsou hojné v EPS biofilmů. SYTO 60 je buňky propustné barvivo používané jako kontrastáin16. Pozorování toto 1 a Syto 60 jodidu u ran inokulovaných biofilmy Pseudomonas aeruginosa (obrázek 4A-D) a Staphylococcus aureus (obrázek 4i-l) ukázaly, že po 3 dnech obvazové léčby se EP v biofilmu v biofilmu významně snížily. obsahující okysličené soli AG a AG1 + + EDTA/BC. Obvazy AG1+ bez dalších antibiofilmových složek významně snížily DNA bez buněk u ran inokulovaných pseudomonas aeruginosa, ale byly méně účinné při ranách inokulovaných Staphylococcus aureus.
In vivo zobrazování biofilmu rány po 3 dnech léčby kontrolními nebo stříbrnými dresinami. Konfokální obrazy Pseudomonas aeruginosa (A - D) a Staphylococcus aureus (I - L) obarvených Toto 1 (zelená) pro vizualizaci extracelulárních nukleových kyselin, složky extracelulárních biofilmových polymerů. Pro barvení intracelulárních nukleových kyselin použijte SYTO 60 (červená). kyseliny. P. Skenovací elektronová mikroskopie ran infikovaných biofilmy Pseudomonas aeruginosa (E - H) a Staphylococcus aureus (M - P) po 3 dnech léčby kontrolou a stříbrnými obvazů. SEM měřítko lišta = 5 µm. Směrem konfokální zobrazovací stupnice = 50 µm.
Skenovací elektronová mikroskopie ukázala, že myši inokulované biofilmovými koloniemi Pseudomonas aeruginosa (obrázek 4e-H) a Staphylococcus aureus (obrázek 4M-P) měly po 3 dnech po 3 dnech po 3 dnech stříbrných obvazů výrazně méně bakterií.
Pro vyhodnocení účinku stříbrných obvazů na zánět rány u myší infikovaných biofilmem byly řezy rány infikovaných biofilmem ošetřeny kontrolními nebo stříbrnými obvazy po dobu 3 dnů imunohistochemicky obarveny protilátkami specifickými pro neutrofily a makrofágy. Kvantitativní stanovení neutrofilů a makrofágů interně. Granulační tkáň. Obrázek 5). Všechny stříbrné obvazy snížily počet neutrofilů a makrofágů u ran infikovaných pseudomonas aeruginosa ve srovnání s ne-antimikrobiálními regulačními dresinami po třech dnech léčby. Ošetření okysličeným obvazem stříbrné soli však vedlo k většímu snížení neutrofilů (p = <0,0001) a makrofágů (p = <0,0001) ve srovnání s jinými testovanými stříbrnými dresinami (obrázek 5i, j). Ačkoli AG1++ EDTA/BC měl větší účinek na biofilm rány, snížil hladinu neutrofilů a makrofágů v menší míře než obvaz Ag1+. Mírné rány infikované biofilmem S. aureus byly také pozorovány po oblékání s Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) a Ag1 ++ EDTA/BC (p = 0,0043) oxisoly ve srovnání s kontrolou. Podobné trendy jsou pozorovány u neutropenie. obvaz (obr. 5k). Avšak pouze okysličené obvazy soli Ag vykazovalo významné snížení počtu makrofágů v granulační tkáni ve srovnání s kontrolou u ran infikovaných biofilmy S. aureus (p = 0,0339) (obrázek 5L).
Neutrofily a makrofágy byly kvantifikovány v ránách infikovaných biofilmy Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus po 3 dnech léčby ne-antimikrobiální kontrolou nebo stříbrnými obvazy. Neutrofily (AD) a makrofágy (EH) byly kvantifikovány v tkáňových řezech obarvených protilátkami specifickými pro neutrofily nebo makrofágy. Kvantifikace neutrofilů (I a K) a makrofágů (J a L) v ránách infikovaných biofilmy Pseudomonas aeruginosa (I a J) a Staphylococcus aureus (K&L). N = 12 na skupinu. Grafy ukazují průměr +/- Standardní chyba, hodnoty významnosti ve srovnání s ne-antibakteriálním ovládacím obvazem, * znamená p = <0,05, ** znamená p = <0,01; *** znamená p = <0,001; označuje p = <0,0001).
Poté jsme posoudili vliv stříbrných obvazů na hojení nezávislé na infekci. Neinfikované excizní rány byly ošetřeny ne antimikrobiálním kontrolním dresinkem nebo stříbrným obvazem po dobu 3 dnů (obrázek 6). Mezi testovanými stříbrnými dresičkami se na makroskopických obrazech objevily pouze rány oxygenované soli, než rány léčené kontrolou (obrázek 6A-D). Kvantifikace oblasti rány pomocí histologické analýzy ukázala, že průměrná plocha rány po ošetření obvazem Ag oxysols byla 2,35 mm2 ve srovnání s 2,96 mm2 pro rány ošetřené kontrolní skupinou, ale tento rozdíl nedosáhl statistické významnosti (p = 0,488) (Obr. 6i). Naproti tomu nebyla pozorována žádná zmenšení oblasti rány po ošetření AG1+ (3,38 mm2, p = 0,757) nebo Ag1++ EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) ve srovnání s kontrolní skupinou. Zvýšená regenerace epitelu byla pozorována při obvazu Ag oxysolu ve srovnání s kontrolní skupinou (30% vs. 22%), ačkoli to nedosáhlo významnosti (p = 0,067), je to poměrně významné a potvrzuje předchozí výsledky. Obvaz s oxysoly podporuje reepitelializaci. -Poelizace neinfikovaných ran17. Naproti tomu léčba obvazů Ag1+ nebo Ag1++ EDTA/BC neměla žádný účinek nebo vykazovala sníženou reepitelializaci ve srovnání s kontrolou.
Vliv obvazu stříbra na hojení ran u neinfikovaných myší s úplnou resekcí. (AD) Reprezentativní makroskopické obrazy ran po třech dnech léčby ne-antimikrobiálním kontrolním dresinkem a stříbrným dresinkem. (EH) Reprezentativní řezy rány obarvené hematoxylin a eosinem. Kvantifikace oblasti rány (I) a procento reepitelizace (j) byly vypočteny z histologických řezů ve středu rány pomocí softwaru pro analýzu obrazu (n = 11–12 na léčebnou skupinu). Grafy ukazují průměr +/- Standardní chyba. * znamená P = <0,05.
Stříbro má dlouhou historii použití jako antimikrobiální terapie při hojení ran, ale mnoho různých formulací a metod doručení může vést k rozdílům v antimikrobiální účinnosti 18. Kromě toho nejsou antibiofilmové vlastnosti specifických systémů dodávání stříbra plně pochopeny. Ačkoli imunitní odpověď hostitele je relativně účinná proti planktonickým bakteriím, je obecně méně účinná proti biofilmy19. Planktonické bakterie jsou snadno fagocytovány makrofágy, ale v biofilmech představují agregované buňky další problémy omezením reakce hostitele, do jaké míry imunitní buňky mohou podstoupit apoptózu a uvolnit prozánětlivé faktory, aby se zvýšila imunitní odpověď20. Bylo pozorováno, že některé leukocyty mohou proniknout biofilmy21, ale jakmile je tato obrana ohrožena, nejsou schopny fagocytosové bakterie22. K podpoře imunitní odpovědi hostitele proti infekci biofilmu rány by měl být použit holistický přístup. Debridement rány může fyzicky narušit biofilm a odstranit většinu bioburden, ale imunitní odpověď hostitele může být neúčinná proti zbývajícímu biofilmu, zejména pokud je imunitní odpověď hostitele ohrožena. Antimikrobiální terapie, jako jsou stříbrné obvazy, tak mohou podporovat imunitní odpověď hostitele a eliminovat infekce biofilmu. Složení, koncentrace, rozpustnost a dodávací substrát mohou ovlivnit antimikrobiální účinnost stříbra. V posledních letech se pokroky v technologii zpracování stříbra zvýšily tyto obvazy efektivnější 9,23. Jak technologie stříbrného oblékání postupuje, je důležité pochopit účinnost těchto obvazů při kontrole infekce rány a co je důležitější, dopad těchto účinných forem stříbra na prostředí a hojení rány.
V této studii jsme porovnávali účinnost dvou pokročilých stříbrných obvazů s konvenčními stříbrnými obvazy, které produkují ionty Ag1+ proti biofilmům pomocí různých modelů in vitro a in vivo. Rovněž jsme posoudili vliv těchto obvazů na prostředí rány a hojení nezávislé na infekci. Pro minimalizaci vlivu dodávací matice byly všechny testované stříbrné obvazy složeny z karboxymethylcelulózy.
Naše předběžné vyhodnocení těchto stříbrných obvazů proti koloniálním biofilmům Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus ukazuje, že na rozdíl od tradičních ag1+ obvazů jsou dva pokročilé stříbrné obvazy, Ag1++ EDTA/BC a okysličené ag soli, účinné zabíjející biofilmové bakterie uvnitř, v rámci. pár dní. Kromě toho tyto obvazy zabraňují reformaci biofilmu po opakované expozici planktonickým bakteriím. Obvaz AG1+ obsahoval chlorid stříbrného, stejnou stříbrnou sloučeninu a základní matrici jako Ag1++ EDTA/BC a měl omezený účinek na životaschopnost bakterií v biofilmu ve stejném období. Pozorování, že obvaz AG1++ EDTA/BC bylo účinnější proti biofilmu než obvaz AG1+ sestávající ze stejné matrice a stříbrná sloučenina podporuje představu, že pro zvýšení účinnosti chloridu stříbrného proti biofilmu jsou nutné další složky, jak bylo hlášeno, jak bylo uvedeno jinde15. Tyto výsledky podporují myšlenku, že BC a EDTA hrají další roli přispívající k celkové účinnosti oblékání a že absence této složky v obvazech Ag1+ mohla přispět k neschopnosti prokázat účinnost in vitro. Zjistili jsme, že okysličené ag solné obvazy produkující ionty Ag2+ a Ag3+ vykazovaly silnější antibakteriální účinnost než Ag1+ a při hladinách podobných Ag1++ EDTA/BC. Vzhledem k vysokému redoxnímu potenciálu však není jasné, jak dlouho ionty AG3+ zůstávají aktivní a účinné proti biofilmům rány, a proto si zaslouží další studium. Kromě toho existuje mnoho různých obvazů, které generují ionty Ag1+, které nebyly v této studii testovány. Tyto obvazy se skládají z různých stříbrných sloučenin, koncentrací a základních matric, které mohou ovlivnit dodávku iontů Ag1+ a jejich účinnost proti biofilmům. Rovněž stojí za zmínku, že existuje mnoho různých modelů in vitro a in vivo používané k vyhodnocení účinnosti obvazů rány proti biofilmům. Typ použitého modelu, jakož i obsah soli a bílkovin v médiu použitých v těchto modelech, ovlivní účinnost obvazu. V našem in vivo modelu jsme umožnili biofilmu zrát in vitro a poté jsme jej přenesli na dermální povrch rány. Imunitní odpověď hostitelské myši je relativně účinná proti planktonickým bakteriím aplikovaným na ránu, čímž se vytváří biofilm, když se rána hojí. Přidání zralého biofilmu do rány omezuje účinnost imunitní odpovědi hostitele na tvorbu biofilmu tím, že umožňuje zralému biofilmu, aby se v ráně před hojením mohl prosadit v ráně. Náš model nám tedy umožňuje vyhodnotit účinnost antimikrobiálních obvazů na zralých biofilmech předtím, než se začnou začnou léčit rány.
Zjistili jsme také, že obvazové přizpůsobení ovlivnilo účinnost stříbrných obvazů na biofilmech a prasečí kůži in vitro. Úzký kontakt s ránou je považován za kritický pro antimikrobiální účinnost obvazu24,25. Obvazy obsahující okysličené ag soli byly v úzkém kontaktu s zralými biofilmy, což vedlo k významnému snížení počtu životaschopných bakterií v biofilmu po 24 hodinách. Naproti tomu, když byla léčena pomocí obvazů Ag1+ a Ag1++ EDTA/BC, zůstal významný počet životaschopných bakterií. Tyto obvazy obsahují stehy po celé délce obvazu, což vytváří mrtvé prostory, které zabraňují úzkému kontaktu s biofilmem. V našich studiích in vitro tyto nekontaktní oblasti zabránily zabití životaschopných bakterií v biofilmu. Posoudili jsme životaschopnost bakterií až po 24 hodinách léčby; Postupem času, jak se obvaz nasycuje, může být méně mrtvého prostoru, což zmenšuje oblast pro tyto životaschopné bakterie. To však zdůrazňuje důležitost složení obvazu, nejen typ stříbra v obvazu.
Zatímco studie in vitro jsou užitečné pro porovnání účinnosti různých stříbrných technologií, je také důležité pochopit účinky těchto obvazů na biofilmy in vivo, kde hostitelská tkáň a imunitní odpovědi přispívají k účinnosti obvazů proti biofilmům. Účinek těchto obvazů na biofilmy rány byl pozorován pomocí skenovací elektronové mikroskopie a barvení biofilmu EPS pomocí intracelulárních a extracelulárních barviv DNA. Zjistili jsme, že po 3 dnech léčby byly všechny obvazy účinné při snižování DNA bez buněk v ranách infikovaných biofilmem, ale obvaz AG1+ byl méně účinný u ran infikovaných Staphylococcus aureus. Skenovací elektronová mikroskopie také ukázala, že výrazně méně bakterií bylo přítomno v ranách ošetřených stříbrnými dresinami, ačkoli to bylo výraznější s okysličeným obvazem Ag soli a obvazem AG1++ EDTA/BC ve srovnání s obvazem AG1+. Tato data ukazují, že testované stříbrné obvazy měly různé stupně dopadu na strukturu biofilmu, ale žádná ze stříbrných obvazů nebyla schopna eradikovat biofilm, což podporuje potřebu holistického přístupu k léčbě infekcí biofilmu; Použití stříbrných náramků. Léčbu předchází fyzický debridement k odstranění většiny biofilmu.
Chronické rány jsou často ve stavu závažného zánětu, přičemž přebytek zánětlivých buněk zůstává v tkáni rány po delší dobu, což způsobuje poškození tkáně a vyčerpává kyslík potřebný pro účinný buněčný metabolismus a funkci v rámci 26. Biofilmy zhoršují toto nepřátelské prostředí rány negativně ovlivňováním hojení různými způsoby, včetně inhibice buněčné proliferace a migrace a aktivace prozánětlivých cytokinů27. Vzhledem k tomu, že stříbrné obvazy jsou efektivnější, je důležité pochopit dopad, který mají na prostředí rány a uzdravení.
Je zajímavé, že ačkoli všechny stříbrné obvazy ovlivnily složení biofilmu, pouze okysličené obvazy stříbrných solí zvýšily reepitelializaci těchto infikovaných ran. Tato data podporují naše předchozí zjištění17 a zjištění Kalan et al. (2017) 28, který prokázal dobré profily bezpečnosti a toxicity okysličených stříbrných solí, protože nižší koncentrace stříbra byly účinné proti biofilmům.
Naše současná studie zdůrazňuje rozdíly ve stříbrné technologii mezi antimikrobiálními stříbrnými dresinami a dopadem této technologie na prostředí rány a infekci nezávislé na hojení. Tyto výsledky se však liší od předchozích studií, které ukazují, že obvaz AG1 + + EDTA/BC zlepšil hojení parametrů zraněných králičích uší in vivo. Může to však být způsobeno rozdíly v zvířecích modelech, době měření a metodami bakteriálních aplikací29. V tomto případě byla měření rány prováděna 12 dní po zranění, aby se umožnilo aktivním složkám obvazu působit na biofilmu po delší dobu. To je podporováno studií, která ukázala, že klinicky infikované vředy nohou ošetřené AG1 + + EDTA/BC původně zvětšily velikost po jednom týdnu léčby a poté během následujících 3 týdnů léčby AG1 + + EDTA/BC a do 4 týdnů od použití ne-antimikrobiálních látek. drogy. CMC obvazy ke zmenšení velikosti vředů30.
Ukázalo se, že některé formy a koncentrace stříbra jsou dříve cytotoxické in vitro 11, ale tyto výsledky in vitro se ne vždy promítají do nepříznivých účinků in vivo. Kromě toho pokroky ve stříbrné technologii a lepší pochopení stříbrných sloučenin a koncentrací v obvazech vedly k rozvoji mnoha bezpečných a účinných stříbrných obvazů. Jak však postupuje technologie stříbrného oblékání, je důležité pochopit dopad těchto obvazů na prostředí rány31,32,33. Dříve bylo hlášeno, že zvýšená rychlost reepitelializace odpovídá zvýšenému podílu protizánětlivých makrofágů M2 ve srovnání s prozánětlivým fenotypem M1. To bylo zaznamenáno v předchozím modelu myši, kde byly obvazy stříbrných hydrogelů porovnány s stříbrným sulfadiazinem a ne-antimikrobiálními hydrogely34.
Chronické rány mohou vykazovat nadměrný zánět a bylo pozorováno, že přítomnost přebytečných neutrofilů může být škodlivé pro hojení ran35. Ve studii u neutrofilů depletovaných myší zpozdila přítomnost neutrofilů reepitelializaci. Přítomnost přebytečných neutrofilů vede k vysokým hladinám proteáz a reaktivních druhů kyslíku, jako je superoxid a peroxid vodíku, které jsou spojeny s chronickými a pomalu hojícími ranami37,38. Podobně zvýšení počtu makrofágů, pokud je nekontrolováno, může vést ke zpožděnému hojení ran39. Toto zvýšení je zvláště důležité, pokud makrofágy nejsou schopny přejít z prozánětlivého fenotypu na fenotyp pro léčení, což má za následek, že rány nedokážou ukončit zánětlivou fázi hojení40. Po 3 dnech léčby všemi stříbrnými dresinami jsme pozorovali pokles neutrofilů a makrofágů v ránách infikovaných biofilmem, ale pokles byl výraznější okysličenými solnými obvazy. Tento pokles může být přímým důsledkem imunitní odpovědi na stříbro, reakce na snížené bioburden nebo rána v pozdějším stádiu hojení, a proto se sníží imunitní buňky v ráně. Snížení počtu zánětlivých buněk v ráně může udržovat prostředí přispívající k hojení ran. Mechanismus účinku toho, jak ag oxysalty podporují hojení nezávislé na infekci, je nejasný, ale schopnost Ag oxysalů produkovat kyslík a ničit škodlivé hladiny peroxidu vodíku, mediátor zánětu, to může vysvětlit a vyžaduje další studium17.
Chronické neléčivé infikované rány představují problém jak pro lékaře, tak pro pacienty. Ačkoli mnoho obvazů tvrdí, že antimikrobiální účinnost, výzkum se jen zřídka zaměřuje na další klíčové faktory ovlivňující mikroprostředí rány. Tato studie ukazuje, že různé stříbrné technologie mají odlišnou antimikrobiální účinnost a co je důležité, různé účinky na prostředí a hojení rány, nezávislé na infekci. Ačkoli tyto studie in vitro a in vivo ukazují účinnost těchto obvazů při léčbě infekcí rány a podporu hojení, pro vyhodnocení účinnosti těchto obvaz na klinice jsou nutné randomizované kontrolované studie.
Použité a/nebo analyzované datové sady během současné studie jsou k dispozici od odpovídajícího autora na přiměřenou žádost.
Čas příspěvku: Jul-15-2024