Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepších výsledků doporučujeme používat novější verzi prohlížeče (nebo v aplikaci Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Pro zajištění trvalé podpory mezitím zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Mikrobiální růst v ranách se často projevuje jako biofilmy, které narušují hojení a je obtížné je vymýtit. Nové stříbrné obvazy údajně bojují s infekcemi ran, ale jejich účinnost proti biofilmu a na infekci nezávislé hojivé účinky jsou obecně neznámé. Pomocí in vitro a in vivo modelů biofilmu Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa uvádíme účinnost obvazů generujících ionty Ag1+; obvazů Ag1+ obsahujících kyselinu ethylendiamintetraoctovou a benzethoniumchlorid (Ag1+/EDTA/BC) a obvazů obsahujících dusičnan stříbrný (Ag oxysoli), které produkují ionty Ag1+, Ag2+ a Ag3+ pro boj s biofilmem rány a jeho vlivem na hojení. Obvazy Ag1+ měly minimální účinky na biofilm rány in vitro a u myší (C57BL/6j). Naproti tomu okysličené soli Ag a obvazy Ag1+/EDTA/BC významně snížily počet životaschopných bakterií v biofilmech in vitro a prokázaly významné snížení bakteriálních a EPS složek v biofilmech ran myší. Tyto obvazy měly odlišné účinky na hojení ran infikovaných biofilmem a ran neinfikovaných biofilmem, přičemž obvazy s okysličenou solí měly příznivější účinky na reepitelizaci, velikost rány a zánět ve srovnání s kontrolní léčbou a jinými stříbrnými obvazy. Různé fyzikálně-chemické vlastnosti stříbrných obvazů mohou mít odlišné účinky na biofilm rány a hojení, a to je třeba zohlednit při výběru obvazu pro léčbu ran infikovaných biofilmem.
Chronické rány jsou definovány jako „rány, které neprocházejí běžnými fázemi hojení řádným a včasným způsobem“1. Chronické rány vytvářejí psychologickou, sociální a ekonomickou zátěž pro pacienty a systém zdravotní péče. Roční výdaje NHS na léčbu ran a souvisejících komorbidit se v letech 2017–2018 odhadují na 8,3 miliardy liber2. Chronické rány jsou v současné době naléhavým problémem i ve Spojených státech, přičemž Medicare odhaduje roční náklady na léčbu pacientů s ranami na 28,1–96,8 miliardy dolarů3.
Infekce je hlavním faktorem bránícím hojení ran. Infekce se často projevují jako biofilmy, které jsou přítomny u 78 % nehojících se chronických ran. Biofilmy se tvoří, když se mikroorganismy nevratně přichytí k povrchům, jako jsou povrchy rány, a mohou se agregovat za vzniku extracelulární polymerní (EPS) komunit. Biofilm v ráně je spojen se zvýšenou zánětlivou reakcí vedoucí k poškození tkáně, což může zpozdit nebo zabránit hojení4. Zvýšení poškození tkáně může být částečně způsobeno zvýšenou aktivitou matrixových metaloproteináz, kolagenázy, elastázy a reaktivních forem kyslíku5. Zánětlivé buňky a biofilmy jsou navíc samy o sobě vysokými spotřebiteli kyslíku, a proto mohou způsobovat lokální hypoxii tkání, čímž buňkám odebírají životně důležitý kyslík potřebný pro účinnou opravu tkání6.
Zralé biofilmy jsou vysoce rezistentní vůči antimikrobiálním látkám, což vyžaduje agresivní strategie pro kontrolu infekcí biofilmů, jako je mechanické ošetření následované účinnou antimikrobiální léčbou. Vzhledem k tomu, že se biofilmy dokáží rychle regenerovat, mohou účinná antimikrobiální látky snížit riziko opětovné tvorby po chirurgickém debridementu7.
Stříbro se stále častěji používá v antimikrobiálních obvazech a často se používá jako léčba první volby pro chronicky infikované rány. Existuje mnoho komerčně dostupných stříbrných obvazů, z nichž každý obsahuje jiné složení, koncentraci a základní matrici stříbra. Pokroky ve stříbrných náramcích vedly k vývoji nových stříbrných náramků. Kovová forma stříbra (Ag0) je inertní; k dosažení antimikrobiální účinnosti musí ztratit elektron, aby vytvořilo iontové stříbro (Ag1+). Tradiční stříbrné obvazy obsahují sloučeniny stříbra nebo kovové stříbro, které se při vystavení kapalině rozkládají za vzniku iontů Ag1+. Tyto ionty Ag1+ reagují s bakteriální buňkou a odebírají elektrony ze strukturálních složek nebo kritických procesů nezbytných pro přežití. Patentovaná technologie vedla k vývoji nové sloučeniny stříbra, oxysolí Ag (dusičnan stříbrný, Ag7NO11), která je součástí obvazů na rány. Na rozdíl od tradičního stříbra rozklad solí obsahujících kyslík vytváří skupenství stříbra s vyšší valencí (Ag1+, Ag2+ a Ag3+). Studie in vitro ukázaly, že nízké koncentrace okysličených solí stříbra jsou účinnější než jednoiontové stříbro (Ag1+) proti patogenním bakteriím, jako jsou Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus a Escherichia coli8,9. Další nový typ stříbrného obvazu obsahuje další složky, a to kyselinu ethylendiamintetraoctovou (EDTA) a benzethoniumchlorid (BC), o kterých se uvádí, že cílí na biofilm EPS a tím zvyšují penetraci stříbra do biofilmu. Tyto nové technologie stříbra nabízejí nové způsoby, jak cílit na biofilmy ran. Dopad těchto antimikrobiálních látek na prostředí rány a hojení nezávislé na infekci je však důležitý, aby se zajistilo, že nevytvoří nepříznivé prostředí rány ani nezpomalí hojení. U několika stříbrných obvazů byly hlášeny obavy z cytotoxicity stříbra in vitro10,11. Cytotoxicita in vitro se však dosud neprojevila toxicitou in vivo a několik obvazů Ag1+ prokázalo dobrý bezpečnostní profil12.
V této studii jsme zkoumali účinnost karboxymethylcelulózových obvazů s novými složeními stříbra proti biofilmu v ranách in vitro a in vivo. Dále jsme hodnotili účinky těchto obvazů na imunitní odpovědi a hojení nezávisle na infekci.
Všechny použité krytí byly komerčně dostupné. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Knutsford, Spojené království) je neantimikrobiální krytí ze 100% karboxymethylcelulózy (CMC) s gelovými vlákny, které bylo v této studii použito jako kontrolní krytí. Byly hodnoceny tři antimikrobiální stříbrné krytí CMC, a to krytí 3M Kerracel Ag (3M, Knutsford, Spojené království), které obsahuje 1,7 % hmotnostních kyslíkaté soli stříbra (Ag7NO11) ve stříbrných iontech s vyšší valencí (Ag1+, Ag2+ a Ag3+). Během rozkladu Ag7NO11 vznikají ionty Ag1+, Ag2+ a Ag3+ v poměru 1:2:4. Krytí Aquacel Ag Extra s obsahem 1,2 % chloridu stříbrného (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Spojené království) 13 a krytí Aquacel Ag + Extra s obsahem 1,2 % chloridu stříbrného (Ag1+), EDTA a benzethoniumchloridu (ConvaTec, Deeside, Spojené království) 14.
Kmeny použité v této studii byly Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) a Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterie byly kultivovány přes noc v bujónu Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Velká Británie). Noční kultura byla poté zředěna v poměru 1:100 v bujónu Mueller-Hinton a 200 µl kultivace bylo naneseno na sterilní 0,2 µm cykloporové membrány Whatman (Whatman plc, Maidstone, Velká Británie) na agarové plotny Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Velká Británie). Tvorba koloniálního biofilmu při 37 °C po dobu 24 hodin. Tyto koloniální biofilmy byly testovány na logaritmické smrštění.
Obvaz nastříhejte na čtvercové kousky o velikosti 3 cm2 a předem je navlhčete sterilní deionizovanou vodou. Obvaz umístěte přes biofilm kolonie na agarové plotně. Každých 24 ha biofilmu bylo odstraněno a životaschopné bakterie v biofilmu (CFU/ml) byly kvantifikovány sériovým ředěním (10−1 až 10−7) v neutralizačním bujónu Day-Angle (Merck-Millipore). Po 24 hodinách inkubace při 37 °C byly provedeny standardní počty bakterií na agarových plotnách Mueller-Hinton. Každé ošetření a časový bod byly provedeny trojmo a počty bakterií byly opakovány pro každé ředění.
Kůže z vepřového břicha se získává ze samic velkých bílých prasat do 15 minut po porážce v souladu s exportními normami Evropské unie. Kůže byla oholena a očištěna alkoholovými ubrousky, poté zmrazena na -80 °C po dobu 24 hodin, aby se kůže devitalizovala. Po rozmrazení byly kousky kůže o velikosti 1 cm2 třikrát promyty PBS, 0,6% chlornanem sodným a 70% ethanolem po dobu 20 minut. Před odstraněním epidermis se veškerý zbývající ethanol odstraní trojnásobným promytím ve sterilním PBS. Kůže byla kultivována na 6jamkové destičce s nylonovou membránou o tloušťce 0,45 μm (Merck-Millipore) nahoře a 3 absorpčními polštářky (Merck-Millipore) obsahujícími 3 ml fetálního bovinního séra (Sigma) doplněného 10% Dulbeccovým modifikovaným Eagleovým médiem (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Koloniální biofilmy byly pěstovány dle popisu pro studie expozice biofilmu. Po 72 hodinách kultivace biofilmu na membráně byl biofilm aplikován na povrch kůže pomocí sterilní inokulační kličky a membrána byla odstraněna. Biofilm byl poté inkubován na dermis prasete po dobu dalších 24 hodin při teplotě 37 °C, aby biofilm mohl dozrát a přilnout ke kůži prasete. Po dozrání a přichycení biofilmu byl přímo na povrch kůže aplikován obvaz o velikosti 1,5 cm2, předem navlhčený sterilní destilovanou vodou, a inkubován při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Životaschopné bakterie byly vizualizovány barvením rovnoměrným nanesením činidla pro viabilitu buněk PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Spojené království) na apikální povrch každého explantátu a inkubací po dobu 5 minut. Pro okamžité pořízení snímků na mikroskopu Leica MZ8 použijte digitální fotoaparát Leica DFC425. Růžově zbarvené oblasti byly kvantifikovány pomocí softwaru Image Pro verze 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Skenovací elektronová mikroskopie byla provedena dle níže popsaného postupu.
Bakterie pěstované přes noc byly zředěny v poměru 1:100 v Mueller-Hintonově bujónu. 200 μl kultury bylo přidáno do sterilní 0,2 μm Whatman cykloporové membrány (Whatman, Maidstone, Spojené království) a naneseno na Mueller-Hintonův agar. Biofilmové plotny byly inkubovány při 37 °C po dobu 72 hodin, aby se umožnila tvorba zralého biofilmu.
Po 3 dnech zrání biofilmu byl přímo na biofilm umístěn čtvercový obvaz o velikosti 3 cm2 a inkubován při 37 °C po dobu 24 hodin. Po odstranění obvazu z povrchu biofilmu byl na povrch každého biofilmu po dobu 20 sekund přidán 1 ml činidla PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, Waltham, MA). Povrchy byly vysušeny a poté byly zaznamenány změny barvy pomocí digitálního fotoaparátu Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Spojené království).
Připravte kultury přes noc na Mueller-Hintonově agaru, jednotlivé kolonie přeneste do 10 ml Mueller-Hintonova bujónu a inkubujte na třepačce při 37 °C (100 ot./min). Po inkubaci přes noc byla kultura zředěna 1:100 v Mueller-Hintonově bujónu a 300 µl bylo naneseno na kruhovou 0,2 µm Whatmanovu cykloporovou membránu (Whatman International, Maidstone, Spojené království) na Mueller-Hintonově agaru a inkubováno při 37 °C po dobu 72 hodin. Zralý biofilm byl aplikován na ránu, jak je popsáno níže.
Veškerá práce se zvířaty byla prováděna na Univerzitě v Manchesteru na základě projektové licence schválené Úřadem pro ochranu zvířat a etický přezkum (P8721BD27) a v souladu s pokyny zveřejněnými Ministerstvem vnitra v rámci revidovaného zákona ASPA z roku 2012. Všichni autoři dodržovali pokyny pro příjezd. Pro všechny studie in vivo byly použity osmitýdenní myši C57BL/6j (Envigo, Oxon, Spojené království). Myši byly anestetizovány isofluranem (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Spojené království) a jejich dorzální plochy byly oholeny a očištěny. Každé myši byla poté pomocí bioptické punčochy Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Spojené království) vytvořena excizní rána o rozměrech 2 × 6 mm. U ran infikovaných biofilmem se na dermální vrstvu rány aplikuje 72hodinový koloniální biofilm vypěstovaný na membráně, jak je popsáno výše, pomocí sterilní inokulační kličky ihned po poranění a membrána se odstraní. Jeden čtvereční centimetr obvazu se předem navlhčí sterilní vodou, aby se udrželo vlhké prostředí rány. Obvazy byly aplikovány přímo na každou ránu a překryty filmem 3M Tegaderm (3M, Bracknell, Spojené království) a po okrajích naneseno tekuté lepidlo Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) pro zajištění dodatečné adheze. Buprenorfin (Animalcare, York, Spojené království) byl podán v koncentraci 0,1 mg/kg jako analgetikum. Myši byly tři dny po poranění utraceny metodou dle Schedule 1 a oblast rány byla dle potřeby odstraněna, rozpůlena a uložena.
Barvení hematoxylinem (ThermoFisher Scientific) a eosinem (ThermoFisher Scientific) bylo provedeno dle protokolu výrobce. Plocha rány a reepitelizace byly kvantifikovány pomocí softwaru Image Pro verze 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Řezy tkání byly odvoskovány v xylenu (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Spojené království), rehydratovány 100–50% ethanolem a krátce ponořeny do deionizované vody (ThermoFisher Scientific). Imunohistochemie byla provedena za použití soupravy VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) dle protokolu výrobce. Primární protilátky proti neutrofilům NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) a makrofágům Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Spojené království) byly zředěny 1:100 v blokovacím roztoku a přidány na povrch řezu, následovaly 2 protilátky Anti-, VectaStain ABC a substrátová souprava Vector Nova Red Peroxidase (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a kontrastně obarveny hematoxylinem. Snímky byly pořízeny pomocí mikroskopu Olympus BX43 a digitálního fotoaparátu Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Spojené království).
Vzorky kůže byly fixovány v 2,5% glutaraldehydu a 4% formaldehydu v 0,1 M HEPES (pH 7,4) po dobu 24 hodin při 4 °C. Vzorky byly dehydratovány pomocí odstupňovaného ethanolu a sušeny v CO2 za použití sušičky kritických bodů Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Spojené království) a naprašovány slitinou zlata a palladia za použití miniaturního rozprašovače/systému doutnavého výboje Quorum SC7620. Vzorky byly zobrazeny pomocí rastrovacího elektronového mikroskopu FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) pro vizualizaci centrálního bodu rány.
Na vyříznutý povrch rány myši byl aplikován jodid Toto-1 (2 μM) a inkubován po dobu 5 minut při 37 °C (ThermoFisher Scientific) a ošetřen Syto-60 (10 μM) při 37 °C (ThermoFisher Scientific). 15minutové Z-stack snímky byly vytvořeny pomocí Leica TCS SP8.
Biologická a technická data z replikátů byla shrnuta do tabulky a analyzována pomocí softwaru Graphpad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). K testování rozdílů mezi jednotlivými léčbami a kontrolním obvazem bez antimikrobiálních látek byla použita jednofaktorová analýza rozptylu s vícenásobnými srovnáními s použitím Dunnettova post hoc testu. Hodnota p < 0,05 byla považována za významnou.
Účinnost vláknitých obvazů ze stříbrného gelu byla nejprve hodnocena na biofilmových koloniích Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa in vitro. Stříbrné obvazy obsahují různé vzorce stříbra: tradiční stříbrné obvazy produkují ionty Ag1+; stříbrné obvazy, které mohou po přidání EDTA/BC produkovat ionty Ag1+, mohou zničit matrici biofilmu a vystavit bakterie stříbru pod antibakteriálním účinkem iontů stříbra.15 a obvazy obsahující okysličené soli stříbra, které produkují ionty Ag1+, Ag2+ a Ag3+. Jeho účinnost byla porovnána s kontrolním obvazem bez antimikrobiálního účinku vyrobeným z gelových vláken. Zbývající životaschopné bakterie v biofilmu byly hodnoceny každých 24 hodin po dobu 8 dnů (obrázek 1). 5. den byl biofilm reinokulován 3,85 × 105S Staphylococcus aureus nebo 1,22 × 105P. aeruginosa za účelem posouzení regenerace biofilmu. Ve srovnání s kontrolními krytími bez antimikrobiálního účinku měly krytí s Ag1+ minimální vliv na životaschopnost bakterií v biofilmech Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa po dobu 5 dnů. Naproti tomu krytí obsahující okysličené Ag a soli Ag1+ + EDTA/BC účinně ničily bakterie v biofilmu během 5 dnů. Po opakované inokulaci planktonickými bakteriemi 5. den nebyla pozorována žádná obnova biofilmu (obr. 1).
Kvantifikace životaschopných bakterií v biofilmech Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa po ošetření stříbrnými obvazy. Kolonie biofilmu Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa byly ošetřeny stříbrnými obvazy nebo kontrolními obvazy bez antimikrobiálního účinku a počet zbývajících životaschopných bakterií byl stanoven každých 24 hodin. Po 5 dnech byl biofilm reinokulován 3,85×105S. Staphylococcus aureus nebo 1,22×105P. Kolonie bakterioplanktonu Pseudomonas aeruginosa byly vytvořeny jednotlivě pro posouzení obnovy biofilmu. Grafy ukazují průměr +/- standardní chybu.
Pro vizualizaci vlivu stříbrných obvazů na životaschopnost biofilmu byly obvazy aplikovány na zralé biofilmy vypěstované na prasečí kůži ex vivo. Po 24 hodinách byl obvaz odstraněn a biofilm byl obarven modrým reaktivním barvivem, které je metabolizováno živými bakteriemi na růžovou barvu. Biofilmy ošetřené kontrolními obvazy byly růžové, což naznačuje přítomnost životaschopných bakterií v biofilmu (obrázek 2A). Naproti tomu biofilm ošetřený obvazem Ag oxysols byl primárně modrý, což naznačuje, že zbývající bakterie na povrchu kůže prasete byly neživotaschopné bakterie (obrázek 2B). U biofilmů ošetřených obvazy obsahujícími Ag1+ bylo pozorováno smíšené modré a růžové zbarvení, což naznačuje přítomnost životaschopných a neživotaschopných bakterií v biofilmu (obrázek 2C), zatímco obvazy EDTA/BC obsahující Ag1+ byly převážně modré s několika růžovými skvrnami, což naznačuje oblasti neovlivněné stříbrným obvazem (obrázek 2D). Kvantifikace aktivních (růžových) a neaktivních (modrých) oblastí ukázala, že kontrolní náplast byla ze 75 % aktivní (obrázek 2E). Krytí Ag1+ + EDTA/BC fungovalo podobně jako krytí s okysličenými stříbrnými solemi, s mírou přežití 13 %, respektive 14 %. Krytí Ag1+ také snížilo životaschopnost bakterií o 21 %. Tyto biofilmy byly poté pozorovány pomocí rastrovací elektronové mikroskopie (SEM). Po ošetření kontrolním krytím a krytím Ag1+ byla pozorována vrstva Pseudomonas aeruginosa pokrývající prasečí kůži (obrázek 2F,H), zatímco po ošetření krytím Ag1+ bylo nalezeno málo bakteriálních buněk a také málo bakteriálních buněk pod nimi. Kolagenová vlákna lze považovat za tkáňovou strukturu prasečí kůže (obrázek 2G). Po ošetření krytím Ag1+ + EDTA/BC byly viditelné bakteriální plaky a pod nimi ležící plaky kolagenových vláken (obrázek 2I).
Vizualizace biofilmu Pseudomonas aeruginosa po ošetření stříbrným obvazem. (A–D) Životaschopnost bakterií v biofilmech Pseudomonas aeruginosa pěstovaných na prasečí kůži byla vizualizována pomocí barviva PrestoBlue 24 hodin po ošetření stříbrnými obvazemi nebo kontrolními obvazemi bez antimikrobiálního účinku. Živé bakterie jsou růžové, neživotaschopné bakterie a prasečí kůže jsou modré. (E) Kvantifikace biofilmů Pseudomonas aeruginosa pěstovaných na prasečí kůži (růžová skvrna) pomocí rastrovací elektronové mikroskopie Image Pro verze 10 (FI) a ošetřených stříbrným obvazem nebo kontrolním obvazem bez antimikrobiálního účinku po dobu 24 hodin. Měřítko SEM = 5 µm. (J–M) Koloniální biofilmy rostly na filtrech a byly obarveny reaktivním barvivem PrestoBlue po 24 hodinách inkubace se stříbrnými obvazemi.
Aby se zjistilo, zda těsný kontakt mezi obvazy a biofilmy ovlivňuje jejich účinnost, byly koloniální biofilmy umístěné na rovném povrchu ošetřeny obvazy po dobu 24 hodin a poté obarveny reaktivními barvivy. Neošetřený biofilm měl tmavě růžovou barvu (obrázek 2J). Na rozdíl od biofilmů ošetřených obvazy obsahujícími okysličené soli stříbra (obrázek 2K) vykazovaly biofilmy ošetřené obvazy obsahujícími Ag1+ nebo Ag1+ + EDTA/BC pruhy růžového zbarvení (obrázek 2L,M). Toto růžové zbarvení naznačuje přítomnost životaschopných bakterií a je spojeno s oblastí stehu uvnitř obvazu. Tyto sešité oblasti vytvářejí mrtvé prostory, které umožňují bakteriím uvnitř biofilmu přežít.
Pro vyhodnocení účinnosti stříbrných obvazů in vivo byly rány myší infikovaných zralými biofilmy S. aureus a P. aeruginosa po excizi v plné tloušťce ošetřeny neantimikrobiálními kontrolními obvazy nebo stříbrnými obvazy. Po 3 dnech léčby makroskopická analýza obrazu ukázala menší velikosti ran při ošetření obvazy s kyslíkatými solemi ve srovnání s neantimikrobiálními kontrolními obvazy a jinými stříbrnými obvazy (obrázek 3A-H). Pro potvrzení těchto pozorování byly rány odebrány a plocha rány a reepitelizace byly kvantifikovány na tkáňových řezech barvených hematoxylinem a eosinem pomocí softwaru Image Pro verze 10 (obrázek 3I-L).
Vliv stříbrných obvazů na povrch rány a reepitelizace ran infikovaných biofilmy. (A–H) Malé buňky infikované biofilmy Pseudomonas aeruginosa (A–D) a Staphylococcus aureus (E–H) po třech dnech léčby kontrolním obvazem bez antimikrobiálního obsahu, obvazem s okysličenou solí Ag, obvazem Ag1+ a obvazem Ag1+. Reprezentativní makroskopické snímky. Rány myší s obvazem Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Reprezentativní infekce Pseudomonas aeruginosa, histologické řezy barvené hematoxylinem a eosinem, použité ke kvantifikaci plochy rány a regenerace epitelu. Kvantifikace plochy rány (M, O) a procentuální reepitelizace (N, P) ran infikovaných biofilmy Pseudomonas aeruginosa (M, N) a Staphylococcus aureus (O, P) (na léčebnou skupinu n = 12). Grafy ukazují průměr +/- standardní chybu. * znamená p = < 0,05 ** znamená p = < 0,01; Makroskopické měřítko = 2,5 mm, histologické měřítko = 500 µm.
Kvantifikace plochy rány infikované biofilmem Pseudomonas aeruginosa (obrázek 3M) ukázala, že rány ošetřené oxysolemi Ag měly průměrnou velikost rány 2,5 mm2, zatímco kontrolní krytí bez antimikrobiálního přípravku mělo průměrnou velikost rány 3,1 mm2, což neodpovídá pravdě. Rány ošetřené Ag1+ nebo Ag1+ + EDTA/BC nevykazovaly žádné zmenšení plochy rány (3,1 mm2 a 3,6 mm2). Léčba krytím s okysličenou solí Ag podpořila reepitelizaci ve větší míře než kontrolní krytí bez antimikrobiálního přípravku (34 % a 15 %; p = 0,029) a Ag1+ nebo Ag1+ + EDTA/BC (10 % a 11 %) (obrázek 3N).
Podobné trendy v ploše rány a regeneraci epitelu byly pozorovány u ran infikovaných biofilmy S. aureus (obrázek 3O). Krytí obsahující okysličené soli stříbra zmenšilo plochu rány (2,0 mm2) o 23 % ve srovnání s kontrolním neantimikrobiálním krytím (2,6 mm2), ačkoli toto snížení nebylo významné (p = 0,304) (obrázek 3O). Kromě toho byla plocha rány ve skupině léčené Ag1+ mírně zmenšena (2,4 mm2), zatímco rána ošetřená krytím Ag1+ + EDTA/BC plochu rány nezmenšila (2,9 mm2). Kyslíkaté soli stříbra také podporovaly reepitelizaci ran infikovaných biofilmem S. aureus (31 %) ve větší míře než u ran ošetřených kontrolními krytími bez antimikrobiálních látek (12 %, p = 0,003) (obrázek 3P). Krytí Ag1+ (16 %, p = 0,903) a krytí Ag+1 + EDTA/BC (14 %, p = 0,965) vykazovaly podobné úrovně regenerace epitelu jako v kontrolní skupině.
Pro vizualizaci vlivu stříbrných obvazů na matrici biofilmu bylo provedeno barvení jodidy Toto 1 a Syto 60 (obr. 4). Jodid Toto 1 je barvivo nepropustné pro buňky, které lze použít k přesné vizualizaci extracelulárních nukleových kyselin, které jsou hojně obsaženy v EPS biofilmů. Syto 60 je barvivo propustné pro buňky používané jako kontrastní barvivo16. Pozorování jodidu Toto 1 a Syto 60 v ránách inokulovaných biofilmy Pseudomonas aeruginosa (obrázek 4A-D) a Staphylococcus aureus (obrázek 4I-L) ukázala, že po 3 dnech ošetření obvazem byl EPS v biofilmu významně snížen. Obvazy obsahující okysličené soli Ag a Ag1+ + EDTA/BC. Ag1+ bez dalších antibiotických složek biofilmu významně snížily volnou buněčnou DNA v ránách inokulovaných Pseudomonas aeruginosa, ale byly méně účinné v ránách inokulovaných Staphylococcus aureus.
Zobrazování biofilmu rány in vivo po 3 dnech léčby kontrolními nebo stříbrnými obvazy. Konfokální snímky Pseudomonas aeruginosa (A–D) a Staphylococcus aureus (I–L) barvených barvou Toto 1 (zelená) pro vizualizaci extracelulárních nukleových kyselin, které jsou součástí polymerů extracelulárního biofilmu. Pro barvení intracelulárních nukleových kyselin použijte Syto 60 (červená). kyseliny. P. Skenovací elektronová mikroskopie ran infikovaných biofilmy Pseudomonas aeruginosa (E–H) a Staphylococcus aureus (M–P) po 3 dnech léčby kontrolními a stříbrnými obvazy. Měřítko SEM = 5 µm. Měřítko konfokálního zobrazování = 50 µm.
Skenovací elektronová mikroskopie ukázala, že myši inokulované biofilmovými koloniemi Pseudomonas aeruginosa (obrázek 4E-H) a Staphylococcus aureus (obrázek 4M-P) měly po 3 dnech léčby pouze stříbrnými obvazy v ranách významně méně bakterií.
Pro vyhodnocení vlivu stříbrných obvazů na zánět ran u myší infikovaných biofilmem byly řezy ran infikovaných biofilmem ošetřených kontrolními nebo stříbrnými obvazy po dobu 3 dnů imunohistochemicky obarveny za použití protilátek specifických pro neutrofily a makrofágy. Kvantitativní stanovení neutrofilů a makrofágů interně. granulační tkáň. Obrázek 5). Všechny stříbrné obvazy snížily počet neutrofilů a makrofágů v ranách infikovaných Pseudomonas aeruginosa ve srovnání s kontrolními obvazy bez antimikrobiálního účinku po třech dnech léčby. Léčba obvazem s okysličenou stříbrnou solí však vedla k většímu snížení počtu neutrofilů (p = <0,0001) a makrofágů (p = <0,0001) ve srovnání s jinými testovanými stříbrnými obvazy (obrázek 5I,J). Ačkoli Ag1+ + EDTA/BC měly větší účinek na biofilm rány, snižovaly hladiny neutrofilů a makrofágů v menší míře než obvaz Ag1+. Středně těžké rány infikované biofilmem S. aureus byly také pozorovány po obvazu s oxisoly Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) a Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) ve srovnání s kontrolní skupinou. Podobné trendy jsou pozorovány u obvazu pro neutropenii (obr. 5K). Pouze obvaz s okysličenou solí Ag však vykazoval významné snížení počtu makrofágů v granulační tkáni ve srovnání s kontrolní skupinou u ran infikovaných biofilmy S. aureus (p = 0,0339) (obrázek 5L).
Neutrofily a makrofágy byly kvantifikovány v ranách infikovaných biofilmy Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus po 3 dnech léčby kontrolním obvazem bez antimikrobiálního přípravku nebo stříbrnými obvazy. Neutrofily (AD) a makrofágy (EH) byly kvantifikovány v tkáňových řezech barvených protilátkami specifickými pro neutrofily nebo makrofágy. Kvantifikace neutrofilů (I a K) a makrofágů (J a L) v ranách infikovaných biofilmy Pseudomonas aeruginosa (I a J) a Staphylococcus aureus (K a L). N = 12 na skupinu. Grafy ukazují průměr +/- standardní chybu, hodnoty významnosti ve srovnání s kontrolním obvazem bez antibakteriálního přípravku, * znamená p = < 0,05, ** znamená p = < 0,01; *** znamená p = < 0,001; označuje p = < 0,0001).
Následně jsme vyhodnotili vliv stříbrných obvazů na hojení nezávislé na infekci. Neinfikované excizní rány byly ošetřeny kontrolním obvazem bez antimikrobiálního obsahu nebo stříbrným obvazem po dobu 3 dnů (obrázek 6). Z testovaných stříbrných obvazů se na makroskopických snímcích jevily menší pouze rány ošetřené obvazem s okysličenou solí než rány ošetřené kontrolní skupinou (obrázek 6A-D). Kvantifikace plochy rány pomocí histologické analýzy ukázala, že průměrná plocha rány po ošetření obvazem Ag oxysols byla 2,35 mm2 ve srovnání s 2,96 mm2 u ran ošetřených kontrolní skupinou, ale tento rozdíl nedosáhl statistické významnosti (p = 0,488) (obr. 6I). Naproti tomu po ošetření obvazem Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) nebo Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) nebylo pozorováno žádné zmenšení plochy rány ve srovnání s kontrolní skupinou. U krytí s Ag oxysolem byla pozorována zvýšená regenerace epitelu ve srovnání s kontrolní skupinou (30 % vs. 22 %), ačkoliv tento výsledek nedosáhl statistické významnosti (p = 0,067), je to poměrně významné a potvrzuje to předchozí výsledky. Krytí s oxysoly podporuje reepitelizaci. - Epitelizace neinfikovaných ran17. Naproti tomu léčba krytím s Ag1+ nebo Ag1+ + EDTA/BC neměla žádný účinek nebo vykazovala sníženou reepitelizaci ve srovnání s kontrolní skupinou.
Vliv stříbrného krytí ran na hojení ran u neinfikovaných myší po kompletní resekci. (AD) Reprezentativní makroskopické snímky ran po třech dnech léčby kontrolním krytím bez antimikrobiálního účinku a stříbrným krytím. (EH) Reprezentativní řezy ran barvené hematoxylinem a eosinem. Kvantifikace plochy rány (I) a procento reepitelizace (J) byly vypočteny z histologických řezů ve středu rány pomocí softwaru pro analýzu obrazu (n = 11–12 na léčebnou skupinu). Grafy ukazují průměr +/- standardní chybu. * průměr p = <0,05.
Stříbro má dlouhou historii používání jako antimikrobiální terapie při hojení ran, ale mnoho různých formulací a způsobů podávání může vést k rozdílům v antimikrobiální účinnosti 18. Navíc vlastnosti specifických systémů pro podávání stříbra v oblasti biofilmu nejsou plně pochopeny. Ačkoli je imunitní odpověď hostitele relativně účinná proti planktonickým bakteriím, obecně je méně účinná proti biofilmům 19. Planktonické bakterie jsou snadno fagocytovány makrofágy, ale v biofilmech představují agregované buňky další problémy tím, že omezují odpověď hostitele do té míry, že imunitní buňky mohou podléhat apoptóze a uvolňovat prozánětlivé faktory ke zvýšení imunitní odpovědi 20. Bylo pozorováno, že některé leukocyty mohou pronikat biofilmy 21, ale nejsou schopny fagocytovat bakterie, jakmile je tato obrana narušena 22. K podpoře imunitní odpovědi hostitele proti infekci biofilmu rány by měl být použit holistický přístup. Debridment rány může fyzicky narušit biofilm a odstranit většinu biozátěže, ale imunitní odpověď hostitele může být neúčinná proti zbývajícímu biofilmu, zejména pokud je imunitní odpověď hostitele narušena. Antimikrobiální terapie, jako jsou stříbrné obvazy, tak mohou podpořit imunitní odpověď hostitele a eliminovat infekce biofilmu. Složení, koncentrace, rozpustnost a substrát pro podávání mohou ovlivnit antimikrobiální účinnost stříbra. V posledních letech pokroky v technologii zpracování stříbra tyto obvazy zefektivnily9,23. S pokrokem v technologii stříbrných obvazů je důležité pochopit účinnost těchto obvazů při kontrole infekce rány a, co je důležitější, vliv těchto silných forem stříbra na prostředí rány a hojení.
V této studii jsme porovnávali účinnost dvou pokročilých stříbrných krytí s konvenčními stříbrnými krytími, která produkují ionty Ag1+ proti biofilmům, za použití různých modelů in vitro a in vivo. Také jsme hodnotili vliv těchto krytí na prostředí rány a hojení nezávislé na infekci. Aby se minimalizoval vliv dodávací matrice, všechna testovaná stříbrná krytí byla složena z karboxymethylcelulózy.
Naše předběžné hodnocení těchto stříbrných krytí proti koloniálním biofilmům Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus ukazuje, že na rozdíl od tradičních krytí Ag1+ jsou dva pokročilé stříbrné krytí, Ag1+ + EDTA/BC a okysličené soli Ag, účinné při dávce 5. Účinně hubí bakterie biofilmu během několika dní. Kromě toho tyto krytí zabraňují opětovné tvorbě biofilmu po opakovaném vystavení planktonickým bakteriím. Krytí Ag1+ obsahovalo chlorid stříbrný, stejnou sloučeninu stříbra a základní matrici jako Ag1+ + EDTA/BC a mělo omezený vliv na životaschopnost bakterií v biofilmu po stejnou dobu. Pozorování, že krytí Ag1+ + EDTA/BC bylo účinnější proti biofilmu než krytí Ag1+ sestávající ze stejné matrice a sloučeniny stříbra, podporuje myšlenku, že pro zvýšení účinnosti chloridu stříbrného proti biofilmu jsou zapotřebí další složky, jak bylo popsáno jinde15. Tyto výsledky podporují myšlenku, že BC a EDTA hrají další roli přispívající k celkové účinnosti krytí a že absence této složky v krytích Ag1+ mohla přispět k neúspěchu v prokázání účinnosti in vitro. Zjistili jsme, že krytí s okysličenými solemi Ag produkujícími ionty Ag2+ a Ag3+ vykazovalo silnější antibakteriální účinnost než Ag1+ a to na úrovních podobných Ag1+ + EDTA/BC. Vzhledem k vysokému redoxnímu potenciálu však není jasné, jak dlouho zůstávají ionty Ag3+ aktivní a účinné proti biofilmům na ráně, a proto si zaslouží další studium. Kromě toho existuje mnoho různých krytí, která generují ionty Ag1+, které nebyly v této studii testovány. Tato krytí se skládají z různých sloučenin stříbra, koncentrací a základních matric, což může ovlivnit dodávání iontů Ag1+ a jejich účinnost proti biofilmům. Za zmínku také stojí, že existuje mnoho různých modelů in vitro a in vivo používaných k hodnocení účinnosti krytí na rány proti biofilmům. Typ použitého modelu, stejně jako obsah solí a proteinů v médiu použitém v těchto modelech, ovlivní účinnost krytí. V našem in vivo modelu jsme nechali biofilm dozrát in vitro a poté jsme jej přenesli na dermální povrch rány. Imunitní odpověď hostitelské myši je relativně účinná proti planktonickým bakteriím aplikovaným na ránu, čímž se během hojení rány vytváří biofilm. Přidání zralého biofilmu k ráně omezuje účinnost imunitní odpovědi hostitele na tvorbu biofilmu tím, že umožňuje zralému biofilmu etablovat se v ráně před zahájením hojení. Náš model nám tak umožňuje vyhodnotit účinnost antimikrobiálních obvazů na zralé biofilmy předtím, než se rány začnou hojit.
Zjistili jsme také, že přizpůsobení krytí ovlivnilo účinnost stříbrných krytí na in vitro pěstovaných biofilmech a prasečí kůži. Těsný kontakt s ránou je považován za kritický pro antimikrobiální účinnost krytí24,25. Krytí obsahující okysličené soli stříbra byla v těsném kontaktu se zralými biofilmy, což vedlo k významnému snížení počtu životaschopných bakterií v biofilmu po 24 hodinách. Naproti tomu při ošetření krytím Ag1+ a Ag1+ + EDTA/BC zůstal významný počet životaschopných bakterií. Tato krytí obsahují stehy po celé délce krytí, což vytváří mrtvé prostory, které brání těsnému kontaktu s biofilmem. V našich studiích in vitro tyto nekontaktní oblasti zabránily usmrcování životaschopných bakterií v biofilmu. Životaschopnost bakterií jsme hodnotili až po 24 hodinách ošetření; Postupem času, jak se krytí stává více nasyceným, může být méně mrtvého prostoru, což snižuje plochu pro tyto životaschopné bakterie. To však zdůrazňuje důležitost složení krytí, nikoli pouze typu stříbra v krytí.
Studie in vitro jsou sice užitečné pro porovnání účinnosti různých technologií s použitím stříbra, ale je také důležité pochopit účinky těchto obvazů na biofilmy in vivo, kde hostitelská tkáň a imunitní reakce přispívají k účinnosti obvazů proti biofilmům. Účinek těchto obvazů na biofilmy ran byl pozorován pomocí rastrovací elektronové mikroskopie a EPS barvení biofilmu za použití intracelulárních a extracelulárních DNA barviv. Zjistili jsme, že po 3 dnech léčby byly všechny obvazy účinné při snižování volné DNA v ranách infikovaných biofilmem, ale obvaz Ag1+ byl méně účinný u ran infikovaných Staphylococcus aureus. Rastrovací elektronová mikroskopie také ukázala, že v ranách ošetřených stříbrnými obvazy bylo přítomno významně méně bakterií, ačkoli to bylo výraznější u obvazu s okysličenou solí stříbra a obvazu Ag1+ + EDTA/BC ve srovnání s obvazem Ag1+. Tato data ukazují, že testované stříbrné obvazy měly různý stupeň vlivu na strukturu biofilmu, ale žádný ze stříbrných obvazů nebyl schopen biofilm eradikovat, což podporuje potřebu holistického přístupu k léčbě infekcí biofilmu ran; použití stříbrných náramků. Léčbě předchází fyzikální debridement k odstranění většiny biofilmu.
Chronické rány jsou často ve stavu těžkého zánětu, kdy v tkáni rány zůstává po delší dobu nadbytek zánětlivých buněk, což způsobuje poškození tkáně a snižuje zásoby kyslíku potřebného pro efektivní buněčný metabolismus a funkci rány26. Biofilmy toto nepřátelské prostředí rány zhoršují tím, že negativně ovlivňují hojení různými způsoby, včetně inhibice proliferace a migrace buněk a aktivace prozánětlivých cytokinů27. Vzhledem k tomu, že se stříbrné obvazy stávají účinnějšími, je důležité pochopit jejich dopad na prostředí rány a hojení.
Je zajímavé, že ačkoli všechny stříbrné obvazy ovlivnily složení biofilmu, pouze obvazy s okysličenou solí stříbra zvýšily reepitelizaci těchto infikovaných ran. Tato data podporují naše předchozí zjištění17 a zjištění Kalana a kol. (2017)28, kteří prokázali dobré profily bezpečnosti a toxicity okysličených solí stříbra, protože nižší koncentrace stříbra byly účinné proti biofilmům.
Naše současná studie zdůrazňuje rozdíly v technologii stříbra mezi antimikrobiálními stříbrnými obvazy a dopad této technologie na prostředí rány a hojení nezávislé na infekci. Tyto výsledky se však liší od předchozích studií, které ukazují, že obvaz Ag1+ + EDTA/BC zlepšil parametry hojení poraněných králičích uší in vivo. To však může být způsobeno rozdíly ve zvířecích modelech, časech měření a metodách aplikace bakterií29. V tomto případě byla měření rány provedena 12 dní po poranění, aby aktivní složky obvazu mohly působit na biofilm po delší dobu. To je podpořeno studií, která ukázala, že klinicky infikované bércové vředy léčené Ag1+ + EDTA/BC se zpočátku zvětšily po jednom týdnu léčby a poté během dalších 3 týdnů léčby Ag1+ + EDTA/BC a do 4 týdnů od užívání neantimikrobiálních léků. obvazy s karboxymethylcelulózovou karboxymethylcelulózou (CMC) ke zmenšení velikosti vředů30.
U některých forem a koncentrací stříbra se již dříve ukázalo, že jsou in vitro cytotoxické 11, ale tyto výsledky in vitro se ne vždy projeví nežádoucími účinky in vivo. Pokroky v technologii stříbra a lepší pochopení sloučenin stříbra a jejich koncentrací v obvazech navíc vedly k vývoji mnoha bezpečných a účinných stříbrných obvazů. S pokrokem v technologii stříbrných obvazů je však důležité pochopit dopad těchto obvazů na prostředí rány 31, 32, 33. Dříve bylo popsáno, že zvýšená rychlost reepitelizace odpovídá zvýšenému podílu protizánětlivých makrofágů M2 ve srovnání s prozánětlivým fenotypem M1. Toto bylo zaznamenáno v předchozím myším modelu, kde byly obvazy na rány ze stříbrného hydrogelu porovnávány se sulfadiazinem stříbra a neantimikrobiálními hydrogely 34.
Chronické rány mohou vykazovat nadměrný zánět a bylo pozorováno, že přítomnost nadbytku neutrofilů může být škodlivá pro hojení ran35. Ve studii na myších s deplecí neutrofilů přítomnost neutrofilů zpoždila reepitelizaci. Přítomnost nadbytku neutrofilů vede k vysokým hladinám proteáz a reaktivních forem kyslíku, jako je superoxid a peroxid vodíku, které jsou spojeny s chronickými a pomalu se hojícími ranami37,38. Podobně nekontrolované zvýšení počtu makrofágů může vést ke zpožděnému hojení ran39. Toto zvýšení je obzvláště důležité, pokud makrofágy nejsou schopny přejít z prozánětlivého fenotypu na prohojivý fenotyp, což má za následek, že rány nedokážou opustit zánětlivou fázi hojení40. Po 3 dnech léčby všemi stříbrnými obvazy jsme pozorovali pokles neutrofilů a makrofágů v ranách infikovaných biofilmem, ale pokles byl výraznější u obvazů s okysličenou solí. Tento pokles může být přímým důsledkem imunitní odpovědi na stříbro, reakce na sníženou biozátěž nebo toho, že rána je v pozdější fázi hojení, a proto je počet imunitních buněk v ráně snížen. Snížení počtu zánětlivých buněk v ráně může udržovat prostředí příznivé pro hojení ran. Mechanismus účinku, jakým oxysoli Ag podporují hojení nezávislé na infekci, není jasný, ale schopnost oxysolí Ag produkovat kyslík a ničit škodlivé hladiny peroxidu vodíku, mediátoru zánětu, by to mohla vysvětlovat a vyžaduje další studium17.
Chronické nehojící se infikované rány představují problém jak pro lékaře, tak pro pacienty. Přestože mnoho obvazů prohlašuje antimikrobiální účinnost, výzkum se jen zřídka zaměřuje na jiné klíčové faktory ovlivňující mikroprostředí rány. Tato studie ukazuje, že různé technologie stříbra mají různou antimikrobiální účinnost a, co je důležité, různé účinky na prostředí rány a hojení, nezávisle na infekci. Ačkoli tyto studie in vitro a in vivo prokazují účinnost těchto obvazů při léčbě infekcí ran a podpoře hojení, je zapotřebí randomizovaných kontrolovaných studií, které by vyhodnotily jejich účinnost v klinických podmínkách.
Datové soubory použité a/nebo analyzované během aktuální studie jsou k dispozici u příslušného autora na základě přiměřené žádosti.
Čas zveřejnění: 15. července 2024